黑豆源新型抗氧化肽VPNHFNAP的MPO靶向作用及多尺度抗氧化活性研究

《Frontiers in Nutrition》：A novel antioxidant peptide from black soybean [Glycine max (L.) Merr.] with verified MPO interaction and multi-scale antioxidant activity

本研究发现黑豆水提物中的新型八肽VPNHFNAP可通过氢键与髓过氧化物酶（MPO）活性位点结合（KD=1.83×10?4?M），在化学水平展现剂量依赖性自由基清除能力（DPPH/ABTS的IC50分别为12.3±0.8μM和9.7±0.5μM），在细胞层面显著提升H2O2损伤的HaCaT细胞存活率2.1倍（p<0.001）并降低ROS水平58±4%。该研究通过计算-实验联用策略为植物源抗氧化肽开发提供了新范式。

　　

引言：氧化应激相关疾病的发展推动了对天然抗氧化剂的需求，其中植物源抗氧化肽因其安全性高、易吸收等优点成为研究热点。髓过氧化物酶（MPO）作为中性粒细胞分泌的关键氧化酶，在过度激活时会产生过量活性氧（ROS），导致脂质过氧化、蛋白质羰基化等损伤，与阿尔茨海默病、动脉粥样硬化等慢性疾病密切相关。黑豆作为中国传统作物，其蛋白质含量高达41.38-44.32%，且富含必需氨基酸，是开发生物活性肽的优质资源。本研究通过整合计算模拟与实验验证，旨在从黑豆中筛选靶向MPO的新型抗氧化肽。

材料与方法：黑豆水提物经超滤获得≤3,000?Da组分，通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定出3,121种肽段。进一步筛选分子量<1,500?Da且长度2-10个氨基酸的1,145种肽进行分子对接，其中八肽VPNHFNAP与MPO（PDB:3F9P）结合能最低（-12.04?kcal/mol）。通过25?ns分子动力学模拟评估复合物稳定性，表面等离子共振（SPR）验证结合亲和力。化学抗氧化实验采用DPPH/ABTS自由基清除 assay，细胞实验以H₂O₂诱导HaCaT细胞建立氧化应激模型，通过CCK-8法和DCFH-DA探针检测细胞活力与ROS水平。

结果与讨论：

计算机模拟筛选：分子对接显示VPNHFNAP可嵌入MPO活性口袋，与链C的ASN162、ARG323及链D的ASP321形成常规氢键，与链B的VAL30、ARG31等残基产生疏水相互作用。分子动力学模拟中，复合物RMSD在5?ns后稳定于0.23±0.057?nm，氢键数维持在5±1个，吉布斯自由能景观呈现集中能阱，表明结合构象稳定。

相互作用验证：SPR分析显示VPNHFNAP与MPO结合呈浓度依赖性，稳态拟合KD值为1.83×10^?4?M（Chi²=0.98），属于中等亲和力结合。肽序列中62.5%为疏水性氨基酸（含N端Val和芳香族Phe），符合抗氧化肽结构特征。

自由基清除活性：在化学水平，VPNHFNAP的DPPH清除率在10?mg/mL时达45.85±5.55%，ABTS清除率为40.4±3.19%，虽低于阳性对照谷胱甘肽（GSH），但呈现剂量效应。分子对接表明其与DPPH/ABTS结合能分别为-4.231?kcal/mol和-4.486?kcal/mol，主要通过氢键实现自由基淬灭。

细胞抗氧化效应：在500?μg/mL?H₂O₂诱导的HaCaT细胞模型中，1,000?μg/mL?VPNHFNAP预处理使细胞存活率从47.82±1.87%提升至64.38±4.22%（p<0.01），ROS水平从2,128.33±127.37?AU降至1,863.16±193.37?AU（p<0.0001）。其保护机制可能与疏水氨基酸增强细胞膜穿透及质子供给能力相关。

结论：本研究通过多尺度策略证实VPNHFNAP是一种具有MPO靶向能力的新型抗氧化肽，兼具直接自由基清除和细胞保护功能，为黑豆副产物高值化利用及功能食品开发提供理论依据。该筛选框架整合生物信息学与多层级验证，为植物肽发现提供了新思路。