基于损伤微环境调控的智能水凝胶设计：用于慢性伤口愈合中的自我再生修复

《Advanced Materials Interfaces》：Damage Microenvironment Guided Responsive Smart Hydrogel Design for Self-Regenerative Repair in Chronic Wound Healing

慢性难愈性皮肤伤口由衰老、糖尿病等因素加剧，传统单靶点疗法效果有限。本研究基于单细胞RNA测序揭示MMP2/9在伤口微环境中显著上调，创新性构建了GCDGTV智能水凝胶系统：通过谷胱甘肽-DA介导的动态响应机制，精准调控VEGF的释放时序，同时赋予水凝胶抗氧化（DPPH清除率提升）、抗菌（抑制E. coli/S. aureus）及生物相容性（细胞存活率>95%）特性。动物实验证实，GCDGTV较传统VEGF缓释体系加速伤口愈合率（28.81% vs 3.369%），促进胶原沉积（9.03% vs 3.369%），并显著增强血管再生（RECA荧光强度提升32.4%）。该系统实现了机械支撑（压缩模量0.89 kPa）、药物释放（MMP2特异性切割效率>90%）与微环境响应的协同优化，为慢性伤口治疗提供了新范式。

　　慢性伤口，如糖尿病性溃疡、老年性皮肤损伤等，已成为全球公共卫生领域的重要挑战。这类伤口不仅严重降低患者的生活质量，还对社会经济造成巨大负担。传统治疗策略往往局限于单一成分的修饰或简单的递送系统，未能有效应对生长因子释放、微环境响应与组织修复之间的复杂关系。因此，开发一种能够智能响应微环境、实现精准生长因子递送的新型材料，成为当前研究的热点。

本研究基于单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，深入分析了伤口愈合过程中基质金属蛋白酶（MMP）的动态变化，并以此为依据设计了一种多功能的谷胱甘肽修饰水凝胶（GCDGTV）。该水凝胶由明胶、多巴胺修饰的羧甲基壳聚糖和MMP响应的VEGF融合蛋白组成，具有两大创新特点：首先，谷胱甘肽的硫醇化学特性使得VEGF能够被精确装载并实现可控释放；其次，伤口微环境中MMP的特异性表达可触发VEGF的按需释放，从而实现生长因子释放与愈合过程的动态匹配。此外，该水凝胶还具备与组织相匹配的机械性能，以及抗氧化和抗菌功能，为慢性伤口治疗提供了一种全新的策略。

在研究过程中，我们首先通过单细胞测序数据集（GSE142471）和公开的转录组数据（GSE76144）分析了皮肤损伤后MMP2和MMP9的表达水平。结果显示，MMP2和MMP9在损伤后的表达显著增加，这一发现与伤口愈合过程中的炎症反应和细胞迁移密切相关。通过进一步的蛋白分析，我们确认了在损伤后的皮肤中，MMP2和MMP9的表达水平远高于正常皮肤，这为后续设计MMP响应型药物释放系统提供了理论依据。同时，研究也揭示了MMP2/9在不同细胞类型中的特异性表达，例如成纤维细胞和内皮细胞，这些细胞在组织重塑和血管生成中起着关键作用。

为了构建一种能够响应微环境的VEGF递送系统，我们设计了一种融合了谷胱甘肽S-转移酶（GST）标签和MMP底物肽序列（TIMP）的VEGF融合蛋白（GTV）。该设计能够有效控制VEGF的释放，避免其在伤口微环境中的非特异性快速释放，从而提高治疗效果。此外，我们还对GTV与水凝胶的结合能力进行了评估，结果表明GTV在水凝胶中的结合效率显著高于单独的VEGF和GST-VEGF（GV），这说明GST与水凝胶之间的高亲和力是实现可控释放的关键。

在水凝胶的制备方面，我们采用了明胶、羧甲基壳聚糖和多巴胺进行复合构建。通过引入多巴胺，我们不仅提升了水凝胶的抗氧化和抗炎性能，还增强了其细胞亲和力和机械强度。此外，为了实现对MMP的响应，我们在水凝胶中引入了TIMP序列，使其能够在伤口微环境中被MMP2和MMP9特异性切割，从而释放VEGF。通过扫描电子显微镜（SEM）观察，我们发现GCD水凝胶具有更为精细的多孔结构，这有助于提高生物活性分子的释放效率，并为细胞迁移和组织修复提供更适宜的微环境。

在性能评估方面，我们通过多种实验手段验证了GCDGTV水凝胶在促进伤口愈合中的有效性。首先，我们利用细胞活力检测（CCK-8）评估了水凝胶的生物相容性，结果表明所有组的细胞存活率均无显著差异，说明水凝胶具有良好的细胞友好性。其次，我们通过水接触角测试和红外热成像分析了水凝胶的亲水性和光热响应能力。结果表明，GCD水凝胶在近红外（NIR）照射下能够迅速升温至39.08°C，这一特性使其具备良好的光热治疗潜力。同时，水凝胶表现出优异的抗氧化能力，能够有效清除自由基，如DPPH和羟基自由基（·OH），从而减轻伤口部位的氧化应激反应。

为了进一步评估水凝胶的抗菌性能，我们采用了菌落计数法，测试了其对大肠杆菌（E. coli）和金黄色葡萄球菌（S. aureus）的抑制效果。结果显示，GC和GCD组的抗菌性能显著优于对照组，这表明多巴胺的引入有效增强了水凝胶的抗菌能力。此外，我们还通过组织学分析（如H&E、Masson和RECA染色）观察了不同治疗组的组织修复情况。结果显示，GCDGTV组的伤口愈合速度显著加快，组织结构更为紧密，且胶原沉积水平明显高于其他组，表明该水凝胶在促进组织修复和血管生成方面具有显著优势。

在体内实验中，我们使用了大鼠皮肤损伤模型，评估了GCDGTV水凝胶的治疗效果。实验结果显示，与对照组相比，GCDGTV组的伤口愈合率显著提高，组织再生和血管生成能力增强，这为该水凝胶在慢性伤口治疗中的应用提供了有力支持。此外，我们还通过统计分析（如t检验和方差分析）验证了各组之间的差异，结果表明GCDGTV在多个指标上均表现出显著的治疗优势。

尽管本研究取得了一些重要成果，但仍存在一定的局限性。例如，目前尚未完全阐明MMP2对VEGF释放的体外影响，这可能与体外实验中难以精确模拟生理浓度有关。未来的研究将进一步探讨这一问题，并结合更复杂的体内模型进行深入分析。此外，我们还计划优化水凝胶的结构设计，以提高其在不同伤口类型中的适用性，并探索其在更广泛的组织修复中的潜力。

综上所述，本研究开发的GCDGTV水凝胶结合了MMP响应、可控生长因子释放、抗氧化和抗菌等多种功能，为慢性伤口的治疗提供了一种创新性的解决方案。该水凝胶不仅能够有效促进血管生成和胶原沉积，还能减轻炎症反应和氧化应激，从而加速伤口愈合。研究结果表明，GCDGTV具有良好的生物相容性和治疗效果，有望成为慢性伤口治疗领域的重要工具。未来的研究将进一步拓展其应用范围，并探索其在其他组织修复中的潜力，为再生医学的发展提供新的思路。