自由采食低蛋白高碳水（LPHC）饮食通过调控能量-剪接轴实现与热量限制（CR）相当的延寿效益

《Aging Cell》：An Ad Libitum-Fed Diet That Matches the Beneficial Lifespan Effects of Caloric Restriction but Acts via Opposite Effects on the Energy-Splicing Axis

本研究发现，一种自由采食的低蛋白高碳水化合物（LPHC）并稀释以不可消化纤维的饮食，能在不依赖禁食的情况下，实现与传统的20%热量限制（CR）相当的延长寿命（lifespan）和改善代谢健康（如胰岛素敏感性、肝脂肪变性）的效果。肝脏蛋白质组学分析揭示，两者作用机制迥异：CR上调线粒体及能量代谢通路，而LPHC则下调这些通路，同时上调RNA代谢及剪接体（spliceosome）通路（如SRSF1），为“能量-剪接韧性轴（energy-splicing resilience axis）”衰老理论提供了实验支持，为开发可持续的人类长寿饮食策略开辟了新途径。

　　

1 引言

营养在衰老过程中扮演核心角色，影响寿命、健康寿命、年龄相关的心血管代谢参数以及衰老的生物学标志。热量限制（Caloric Restriction, CR）是研究最广泛的延缓衰老、延长多种生物寿命的饮食方法。在脊椎动物如小鼠、大鼠和非人灵长类动物中，CR通常通过将食物摄入限制在自由采食量的50%–80%来实施，以单日份量提供并补充微量营养素。这种喂养方案会同时导致能量限制和延长的禁食期，因为动物通常在几小时内消耗完所有可用食物，然后直到下一个喂养周期都处于禁食状态。

几何框架（Geometric Framework）提供了一种方法来梳理表型结果与营养干预之间的复杂关系。在先前对自由采食小鼠的研究中，应用该框架证明膳食蛋白质与碳水化合物的比例影响寿命。该研究在某些饮食中加入不可消化的纤维素，以模拟自由采食动物中CR的效果。这是首次通过膳食稀释在小鼠中实现CR的实例。正如预期，摄入高纤维素饮食的小鼠作为对营养稀释的代偿反应增加了食物摄入量，但它们的总能量摄入减少了。然而，先前的研究未包括与常规CR处理组的比较。因此，有人认为观察到的自由采食低蛋白高碳水化合物（Low-Protein, High-Carbohydrate, LPHC）饮食的寿命益处可能无法与常规热量限制相媲美。

随后的研究表明，在涉及禁食的标准CR饮食中，小鼠的老年保护效果比通过膳食稀释实现的CR更为明显。值得注意的是，该研究使用了50%纤维素的膳食稀释。我们之前发现，这种高程度的纤维素膳食稀释会缩短自由采食小鼠的寿命，而更适度的稀释则显示出延长寿命的证据。

一种可能影响生长和寿命的最新营养干预是外显子组匹配（exome-matching）。这涉及操纵膳食蛋白质，使膳食氨基酸的比例与外显子组相匹配，从而在生理条件下满足（无过量）蛋白质翻译的预测需求。在果蝇中，外显子匹配饮食同时优化了生长和繁殖，且对寿命没有负面影响。在选择实验中，外显子匹配饮食比非外显子匹配饮食更受青睐。在食用极低蛋白（6%）自由采食饮食的小鼠中，外显子匹配优化了生长和生殖功能。

在人类中，自愿通过禁食进行热量限制对大多数人来说是不可持续的，一种能够产生与热量限制相似的抗衰老益处且无需禁食期的自由采食饮食具有明显的临床优势。本研究比较了小鼠在三种饮食下的寿命和衰老情况：自由采食对照饮食（Con）；常规20% CR饮食；以及自由采食的低蛋白高碳水化合物（LPHC）饮食，该饮食通过不可消化纤维稀释引起热量限制。所有饮食中膳食蛋白质的氨基酸组成均经过外显子匹配，以减少由氨基酸不平衡引起的食物摄入变异。

2 结果

2.1 寿命、食物和能量摄入以及体重

饮食组成如表S1所示，实验设计如图1A所示。Con和CR饮食含有18%蛋白质、67%碳水化合物、15%脂肪（按膳食能量含量百分比计）和约4%纤维（按食物重量百分比计）。CR组小鼠摄入的食物比自由采食Con组小鼠少20%。LPHC饮食含有6%蛋白质、79%碳水化合物和15%脂肪，并用不可消化纤维稀释了30%（相对于Con饮食最终稀释约25%）。所有饮食中的蛋白质均经过外显子匹配，并补充了AIN93微量矿物质和维生素。饮食从12周龄开始。

生存曲线显示，与自由采食对照饮食相比，LPHC和CR饮食对寿命的影响相似。LPHC和CR饮食分别使中位寿命显著增加了17%和11%。CR与LPHC的中位寿命之间无统计学显著差异。最大寿命分别为对照组1008天、CR组1179天和LPHC组1115天。性别不是显著的影响修饰因子。

按方案，CR小鼠的食物和能量摄入比自由采食对照小鼠减少了20%。尽管LPHC饮食的食物摄入量比对照饮食增加了16%–17%，但这并未完全抵消纤维素稀释（即低能量密度）的影响，因此能量摄入减少了15%。该值与使用常规CR方案报告的20%–50%的能量摄入减少范围相比较低。LPHC饮食引起的寿命延长并非继发于禁食期，因为小鼠可以自由获取食物。

2.2 身体成分和代谢特征

饮食干预9个月后（12月龄），自由采食Con饮食组的体重、体脂百分比和瘦体重最高，且总体而言雄性高于雌性。在雄性中，LPHC饮食的体脂低于CR饮食。与对照组相比，CR和LPHC饮食均相似地降低了血糖和胰岛素水平。因此，LPHC和CR饮食小鼠的胰岛素敏感性指数均较低（即敏感性改善）。尽管CR和LPHC饮食的口服葡萄糖耐量试验（oGTT）曲线较低，但仅CR组的曲线下面积（AUC）存在显著差异。

LPHC和Con组的呼吸交换率（RER）未显示出与CR相同的稳健昼夜波动范围（介于1，碳水化合物主导代谢，和0.7，脂肪主导代谢之间），这很可能与CR相关的禁食有关。然而，平均24小时RER没有差异。CR饮食小鼠能量摄入的减少（雄23%，雌19%）近似于其能量消耗的减少（雄21%，雌14%）。同样，LPHC饮食小鼠能量摄入的减少（雄15%，雌15%）与其能量消耗的减少（雄13%，雌8%）相匹配。值得注意的是，CR组的能量摄入和能量消耗减少幅度大于LPHC饮食组，这表明LPHC并非仅通过减少能量摄入起作用。

为确定饮食对代谢反应的年龄相关影响，第二个队列的小鼠在饮食干预1、6、12或18个月后（即4、9、15和21月龄）被处死。对照小鼠的体重、体脂百分比和瘦体重随年龄增长而增加。在雄性CR小鼠中，体脂百分比也随年龄增长而增加，这在此前的CR研究中已有报道，但其机制尚不清楚。与对照和CR饮食相比，LPHC饮食动物的体重和体脂在不同年龄阶段相对稳定。

对照饮食小鼠的葡萄糖和胰岛素稳态随年龄增长而恶化。CR和LPHC饮食小鼠的这些指标保持稳定，因此在老年阶段，这些指标优于对照饮食小鼠。对照小鼠和雄性CR小鼠的肝脏重量和肝脏甘油三酯水平随年龄增长而增加。肝脏组织学结果与此一致，显示饮食干预18个月后，对照小鼠和雄性CR小鼠出现肝脂肪变性。在这些代谢、身体成分和肝脏结果指标上，CR饮食在任何时候都没有优于LPHC饮食。实际上，在雄性中，LPHC饮食在某些参数上表现优于CR。

2.3 肝脏蛋白质丰度和通路分析

为确定LPHC和CR饮食干预是否通过相似或不同的细胞机制起作用，对纵向处死队列小鼠的肝脏蛋白质组进行了研究。多维标度图表明，性别、年龄和饮食均影响蛋白质组。因此，后续分析确定饮食影响时考虑了与性别和年龄的相互作用。维恩图显示，与对照组相比，LPHC组差异表达的蛋白质数量（在检测到的3233种蛋白质中有1885种）多于CR组与对照组相比（1351种蛋白质）。有863种蛋白质的丰度变化在LPHC和CR中是共同的。有1022种蛋白质是LPHC独有的，488种蛋白质是CR独有的。

两种饮食共同影响的主要通路是线粒体及能量代谢相关通路。对CR和LPHC共享的共同蛋白质的进一步分析考虑了一种可能性，即蛋白质丰度调节的方向在两种饮食之间可能相反。事实上，这些线粒体通路通常在CR饮食中上调，而在LPHC饮食中下调。一些感兴趣的蛋白质例子包括线粒体蛋白（如CPT2、AASS、NDUFA4和TMEM135），与CR和/或对照组相比，LPHC组的这些蛋白质丰度降低。

CR独有的丰度变化蛋白质包括与线粒体（上调）、蛋白水解、转运和分解代谢（下调）通路相关的蛋白质。LPHC独有的上调丰度变化蛋白质包括参与RNA代谢和剪接体通路的蛋白质。这包括SRSF1，它是细胞能量与剪接体之间反向关系的关键信号蛋白。

3 讨论

常规CR通常涉及20%–50%的能量摄入减少和餐间长时间的禁食间隔，对人类而言难以维持，在临床试验环境中坚持此类饮食的参与者不到四分之一。本研究发现，一种自由采食、低蛋白、高碳水化合物并用不可消化纤维素稀释的LPHC饮食，所带来的中位、平均和最大寿命的增加，与传统的20% CR加禁食期所达到的效果相当。

在CR组中，小鼠获得的食物比其自由采食对照组少20%，以单日份量提供，被迅速消耗，从而诱导了延长的禁食期。这与能量摄入和能量消耗相似程度的减少（19%–23%）相关。LPHC饮食导致能量摄入减少15%，尽管总食物消耗量增加，因为通过纤维素稀释添加的体积限制了饮食的能量密度。这与能量消耗减少8%–13%相关。CR和LPHC饮食之间的这些差异虽然不大，但表明LPHC并非仅通过减少能量摄入起作用，这一点得到了肝脏蛋白质组学结果的证实。LPHC饮食产生了与CR相当的寿命和代谢益处，包括体重减轻，并且这是在无需强制禁食的情况下实现的。LPHC饮食对胰岛素和葡萄糖代谢以及肝脂肪变性具有积极影响。如果这种方法被证明可转化应用于人类群体，这些特性使其极具前景。

关于营养调节衰老和延长寿命是否或可以通过以下因素介导，一直存在争议：能量摄入的减少；蛋白质摄入的减少，单独或相对于碳水化合物的比例（P:C），或特定氨基酸的摄入；禁食期；以及能量摄入反应中昼夜节律的影响。我们的研究表明，禁食期并非寿命延长的先决条件。

本研究中LPHC饮食的寿命益处可能源于以下三个因素中的一个或多个：蛋白质摄入减少和低蛋白碳比（P:C）；热量摄入减少15%，尽管这对与线粒体和能量代谢相关的肝脏蛋白质产生了与传统CR相反的影响；以及纤维素的影响，例如肠道微生物组组成的改变。我们先前已表明，蛋白质与碳水化合物的比例独立于热量摄入影响寿命，在果蝇和其他昆虫中使用水（而非纤维素）作为自由采食条件下的膳食稀释剂也报告了类似结果。我们还表明，在小鼠中，纤维素稀释影响肠道微生物群落的多样性，并且群落结构受P:C影响。解析这些效应是未来工作的一个有趣目标。

肝脏蛋白质组学揭示了饮食对基本细胞过程（包括线粒体代谢和RNA剪接）的显著影响。这与肝脏在调节对营养摄入的系统性反应中的核心作用一致。在CR组中，参与线粒体通路和能量代谢的蛋白质丰度增加，而LPHC饮食则与线粒体通路和能量代谢相关蛋白质的减少相关。在之前的一项研究中，我们观察到膳食蛋白质影响与线粒体相关的肝脏蛋白质，这一发现得到了本研究的支持，因为LPHC饮食导致蛋白质摄入量低于CR饮食。

LPHC饮食与参与RNA剪接和代谢的蛋白质丰度增加相关，包括剪接因子SRSF1。SRSF1将细胞应激（包括营养应激源）与增强的剪接体功能和替代转录本的生成联系起来。Ferrucci及其同事提出的“衰老的能量-剪接韧性轴理论”指出，对与衰老相关的应激源的韧性需要增加RNA剪接和产生替代转录本。他们确定SRSF1是协调CR反应的关键信号因子，导致RNA剪接增强。我们的研究同意这一假设并将其扩展到肝脏，表明LPHC饮食导致线粒体蛋白质减少、RNA剪接蛋白质增加、SRSF1蛋白水平升高以及寿命延长。重要的是，我们发现是稀释导致的CR与LPHC饮食的结合，而非单独的常规CR，触发了这种“抗衰老韧性”反应。这与CALORIE研究一致，后者在人类肌肉中未发现SRSF1是CR调控的基因。CR组和LPHC组在剪接方面差异的可能解释可能是通过AMPK信号传导。这种在CR中被激活的营养感应酶，已知可磷酸化SRSF1，从而降低其与RNA结合的能力，进而减少选择性前mRNA加工。支持这一假设的另一条证据是，用已知的AMPK激活剂二甲双胍处理来自早衰症（HGPS）的细胞，会降低SRSF1的mRNA水平，并降低病理性选择性剪接的lamin A的水平。因此，与自由采食LPHC饮食相关的这种蛋白质组学特征表明，通过同时调节参与线粒体和剪接体通路的蛋白质丰度，它可能提供超越CR的额外益处。

总之，一种经过外显子匹配并用不可消化纤维稀释的自由采食LPHC饮食，在延长寿命方面与CR一样有效。与CR相比，LPHC饮食可能具有额外的代谢益处并涉及新的机制。虽然CR饮食导致线粒体蛋白质增加，但自由采食的LPHC饮食导致线粒体通路减少以及SRSF1和RNA剪接增加。这一结果为衰老的能量-剪接韧性轴理论以及作用于该轴的饮食干预提供了营养学基础。

4 材料与方法

4.1 动物与饲养

所有实验均获得悉尼大学动物伦理委员会批准（协议号2018/1453和2019/1513）。

雄性和雌性C57BL/6J_Ozarc小鼠于4周龄时从Ozgene获得，饲养于澳大利亚悉尼大学Charles Perkins中心的生物服务部门。所有小鼠每笼饲养三只，室温（21°C–23°C）下维持12小时昼夜光暗循环，不进行运动训练。动物在开始实验饮食前自由采食标准饲料。笼具使用纤维素垫料，每两周更换一次，以尽量减少高频更换对笼内微环境和动物健康的负面影响。

动物实验分为两部分：时间点研究（每个性别/饮食/时间点n=9）和寿命研究（每个性别/饮食/时间点n=24）。在12周龄时，两项研究中的小鼠被随机分配到对照（Con）、低蛋白高碳水化合物低能量密度饮食（LPHC）或20%热量限制（20% CR）饮食。饮食组成见表S1，购自Specialty Feeds Ltd.（珀斯，澳大利亚）。所有饮食均自由采食，CR组除外，该组动物每天（约下午3点）喂食预先称重的对照饮食份量，相当于对照小鼠测量食物摄入量的80%。

体重每两周测量一次，食物摄入量（按笼）每月测量一次。时间点研究中在预定实验终点前达到伦理终点的小鼠（时间点研究216只动物中的8只）被处死并排除在研究之外。寿命研究内达到的伦理终点作为寿命分析的数据点保留，但出现直肠脱垂且无继发性疾病的动物除外（根据Pak等人2021年的方法）；寿命研究143只动物中有10只，因为小鼠容易发生此疾病。这些动物在处死日期被删失，并在图1B–D的生存曲线中以垂直短划线标示。

4.2 身体成分

时间点研究中的小鼠在实验终点前一周（饮食干预1、6、12或18个月），通过磁共振成像使用EchoMRI 900测量瘦组织、脂肪量和液体。寿命研究动物仅在饮食干预9个月时评估身体成分。

4.3 葡萄糖耐量试验和胰岛素测量

小鼠（所有时间点小鼠和部分寿命研究小鼠）禁食5小时，使用手持血糖仪从尾尖测量基础血糖。动物灌胃25%葡萄糖溶液（2 g/kg瘦体重），随后在15、30、45、60和90分钟测量血糖。

在基线时从尾部额外采集10μL血液，使用酶联免疫吸附测定法测定胰岛素水平。使用空腹血糖和胰岛素测量值的乘积估算胰岛素敏感性指数。

4.4 全身热量测定

在饮食干预9个月时，一部分寿命研究动物使用Promethion高清晰度呼吸测量系统进行间接热量测定。小鼠单笼饲养在Promethion笼中48小时（包括24小时适应期），热量测定数据和体力活动使用MetaScreen软件测量和计算。测量耗氧量（VO₂）和二氧化碳产生量（VCO₂）以确定呼吸交换率（RER = VCO₂/VO₂）。

4.5 动物处死和组织收集

指定用于时间点研究的动物在其指定的实验终点（饮食干预1、6、12或18个月，对应4、9、15和21月龄）被处死，用于组织采集和分析。小鼠通过腹腔注射Lethabarb（60 mg/mL戊巴比妥钠）麻醉，并在麻醉状态下通过心脏穿刺放血处死。所有组的组织收集在09:00至13:00之间进行。热量限制小鼠在处死当天不喂食。小鼠处死顺序随机化以防止时间偏差。

心脏穿刺获得的血液放入含EDTA的1.5 mL微量离心管中，以10,000 rpm离心，血浆转移至另一管后于-80°C储存。肝脏解剖称重后，一小部分在10%中性缓冲福尔马林中固定24小时，然后转移至70%乙醇，再进行石蜡包埋。其余肝脏速冻后于-80°C储存。

4.6 甘油三酯测定

时间点研究的肝脏样本按照简单的脂质提取方案分析甘油三酯含量。20–30 mg组织粉末浸没在4 mL甲醇:氯仿（1:2）混合物中，充分涡旋。脂质通过在4°C旋转管混合器上孵育过夜来提取。第二天，加入2 mL 0.6% NaCl，样品涡旋后在室温下离心（2000 rpm，10分钟）。下层相转移至玻璃管中，用氮气吹干仪完全干燥。干燥的样品随后用500 μL乙醇重悬。

甘油三酯含量相对于甘油标准品进行定量。样品和标准品（10 μL）加入96孔板，在37°C下干燥，然后每孔加入300 μL甘油三酯试剂。样品在37°C孵育30分钟，在490 nm波长下读取吸光度。

4.7 蛋白质组学样品制备和质谱分析

从所有时间点研究小鼠的肝脏中，称取30–50 mg冷冻组织粉末至2 mL微量离心管中，在1 mL SDC缓冲液（4%脱氧胆酸钠，100 mM TrisHCL，pH 8.0）中于95°C裂解10分钟（在热混合器上1000 rpm），在水浴超声仪中室温超声30分钟，然后在室温下以18,000 g离心10分钟。澄清的裂解液转移至新管并于-30°C储存。将5 μL还原/烷基化混合物（50 mM TCEP，200 mM氯乙酰胺，溶于SDC缓冲液）加入1 mL 96深孔板中的20 μL澄清组织裂解液，在热混合器上95°C、1000 rpm孵育10分钟，然后加入75 μL水。加入1 μg胰蛋白酶后，蛋白质在1000 rpm、37°C下消化16小时。

肽段使用安装在定制96孔板离心架中的SDB-RPS stage tips进行清理。肽段用12.5 mM NH₄OH、80%乙腈洗脱，在真空离心机中干燥，并重悬于40–60 μL 5%甲酸中。溶于5%（v/v）甲酸的肽段直接进样（进样体积50 μL）到2.1 × 50 mm, 1.9 μm, InfinityLab Poroshell 120 EC-C18分析柱上。肽段在13.8分钟内通过梯度从9%乙腈洗脱至29%乙腈，然后在0.6分钟内从29%洗脱至42%，流速0.8 mL/min，随后在40°C下用80%乙腈洗脱2分钟。Sciex TripleTOF 6600系统使用TurboSpray离子源在扫描SWATH模式下以正极性运行。扫描SWATH DIA方法包含51个可变宽度的SWATH DIA窗口，覆盖Q1质量范围390–900 Da。

4.8 蛋白质组学数据分析

原始数据在DIANN中处理，使用计算机生成的谱图库，标准设置激活“高精度”、“稳健LC”和“MBR”。肽段针对从www.uniprot.org于2022年11月1日下载的小鼠参考蛋白质组进行搜索。生成的唯一基因表读入R，并去除缺失值数量高的样品（>40%）。强度值进行对数转换（以2为底）。为处理缺失值，根据在主要对比组（性别和年龄）内缺失值百分比（>30%）是否存在差异，将蛋白质分为随机缺失（MAR）和非随机缺失（MNAR）。过滤掉在少于70%样品中存在的蛋白质，除非被确定为性别和/或年龄的MNAR。对确定为MNAR的蛋白质的缺失值使用QFeatures包中的左截尾插补方法进行插补。使用limma分析数据，使用以下模型（model.matrix(~diet + timepoint + sex + batch)）和设置（eBayes: trend = T, robust = T）。p值使用limma中的标准Benjamini-Hochberg校正进行多重比较校正。使用limma中的plotMDS()函数生成MDS图。使用clusterProfiler包对所有检测到的蛋白质背景进行蛋白质过表达分析。

4.9 统计分析

n值表示单个小鼠，或食物摄入测量的单个笼子。数据表示为平均值±SEM，除非图注中另有说明。除蛋白质组数据外，结果通过双向或三向方差分析进行分析。如果方差分析达到统计学显著性（p < 0.05），则使用Tukey事后检验。使用RStudio进行统计分析。统计学显著性设定为p < 0.05。