LILRA5调控先天免疫细胞活性氧生成的功能与机制研究

《European Journal of Immunology》：LILRA5 Functions to Induce ROS Production on Innate Immune Cells

本研究首次开发了具有激动剂特性的高特异性抗LILRA5单克隆抗体，揭示LILRA5在人类吞噬细胞表面的动态表达规律及其通过FcRγ信号通路诱导活性氧（ROS）产生的功能机制。文章通过多组学数据分析证实LILRA5转录本在脓毒症等系统性感染中显著上调，并发现可溶性LILRA5（sLILRA5）在患者血清中异常升高，为理解该孤儿受体在免疫调控中的作用提供了新视角。

　　

ABSTRACT

激活免疫受体为吞噬细胞启动关键效应功能提供了机制基础，从而促进微生物的杀伤。白细胞免疫球蛋白样受体A5（LILRA5）是一种在人类吞噬细胞上表达并与FcRγ共定位的孤儿免疫受体，其特征至今尚未明确。为解决这一问题，研究团队开发了具有激动剂特性的高特异性抗LILRA5单克隆抗体。研究显示LILRA5在初始单核细胞和中性粒细胞上表达，其交联可刺激ROS产生。虽然LILRA5转录本增加与脓毒症相关，但研究者在无脓毒症并发症的系统性感染患者中也观察到水平升高。全血离体细菌感染并未改变表面LILRA5表达，但LPS刺激改变了表达水平，表明表面LILRA5表达是动态的，可能受转录后调控，随不同刺激或时间而变化。脓毒症患者血清和LPS刺激的单核细胞上清液中可溶性（s）LILRA5增强，表明LILRA5从细胞表面脱落或sLILRA5亚型的表达提供了调节表面LILRA5表达水平的机制。最终，研究证实表面LILRA5表达的改变影响LILRA5诱导的ROS产生能力。因此，LILRA5是吞噬细胞上表达的一种动态调节的激活受体，可刺激ROS产生。

1 Introduction

吞噬性免疫细胞如中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞在针对感染的先天免疫应答中发挥关键作用。它们能够通过吞噬作用吞噬入侵病原体，释放抗菌分子并产生活性氧（ROS）。这归因于细胞表面表达的检测感染迹象的免疫受体。鉴于吞噬作用、脱颗粒和ROS生成的重要性，这些过程可通过几种先天免疫受体激活。这包括通过其胞质尾中的免疫受体酪氨酸基于激活基序（ITAM）发出信号的受体，或那些与含ITAM的FcRγ共关联的受体。尽管几种先天免疫受体与FcRγ共关联，但它们激活吞噬细胞、诱导脱颗粒和/或刺激ROS产生的能力尚不清楚。

LILRA5是白细胞免疫球蛋白样受体（LILR）家族的成员。LILRA5转录本由中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞表达。虽然表面LILRA5表达已在单核细胞和巨噬细胞上报道，但中性粒细胞表面的LILRA5表达仍不清楚。LILRA5包含两个胞外免疫球蛋白（Ig）结构域、一个与含ITAM的FcRγ共定位的跨膜区和一个短的胞质尾。它也可以以可溶性形式表达，称为sLILRA5。尽管LILRA5的配体未知，但交联单核细胞上的LILRA5可诱导FcRγ关联、FcRγ中的ITAM磷酸化和促炎细胞因子的释放。删除LILRA5基因的小鼠对细菌性角膜炎的易感性增加并出现炎症反应失调。

由于高特异性抗LILRA5单克隆抗体的稀缺以及对内源性和外源性LILRA5配体缺乏了解，LILRA5的表达和功能研究甚少。近期报告显示，LILRA5转录本在人类细菌性角膜炎和人类脓毒症中显著增加。这提示LILRA5在微生物防御中具有作用，并可能作为快速诊断病原体触发炎症的有用生物标志物。在本研究中，研究者开发了针对LILRA5的高特异性抗体作为研究其表达和功能的工具。研究者调查了健康和疾病状态下吞噬细胞上LILRA5转录本水平和表面LILRA5表达，并评估了交联LILRA5是否能触发ROS产生和吞噬作用。

2 Results

2.1 Development of LILRA5-Specific mAb with Agonistic Properties

首先，使用重组（r）LILRA5免疫BALB/c小鼠。从骨髓瘤NS1/0细胞与脾细胞融合产生的杂交瘤中纯化出抗LILRA5 P4-11A单克隆抗体。抗LILRA5 P4-11A单克隆抗体与包被有人类rLILRA5的磁珠结合，但不与任何可能发生交叉反应的最密切相关的人类rLILR结合，也不与来自不同家族的称为LAIR1的免疫受体结合。此外，抗LILRA5 P4-11A以浓度依赖性方式识别rLILRA5，表明其对检测LILRA5具有高特异性。流式细胞术分析还显示，与对照U937细胞相比，抗LILRA5 P4-11A与LILRA5阳性的U937细胞的结合增强，表明抗LILRA5 P4-11A可以特异性检测细胞表面表达的LILRA5。

由于交联对于研究单克隆抗体诱导的LILRA5功能至关重要，研究者测试了抗LILRA5 P4-11A是否能在报告细胞模型中交联并激活LILRA5。研究者生成了表达LILRA5CD3ζ融合蛋白于细胞表面的2B4T NFAT-GFP报告细胞，这是识别功能性LILR配体的既定方法。抗CD3在LILRA5和对照细胞中诱导GFP表达，而兔多克隆抗LILRA5仅在LILRA5细胞中诱导GFP表达。值得注意的是，抗LILRA5 P4-11A在表达LILRA5CD3ζ的2B4T NFAT-GFP细胞中诱导GFP表达，但在对照细胞中不诱导。因此，抗LILRA5 P4-11A对LILRA5具有激动特性，可作为研究LILRA5功能的分子工具。

接下来，研究者调查了抗LILRA5 P4-11A是否可用作ELISA测定中的捕获抗体。研究者使用rLILRA5-His作为标准品，兔抗LILRA5多克隆抗体进行检测。该ELISA以浓度依赖性方式检测到rLILRA5-His，但未检测到作为对照蛋白的rLAIR1-His。因此，抗LILRA5 P4-11A抗体与人类LILRA5结合，不与其他LILR发生交叉反应，并具有激动特性。

2.2 LILRA5 is Expressed on the Surface of Human Neutrophils and Monocytes

由于从未报道过中性粒细胞上的LILRA5蛋白水平，研究者使用抗LILRA5 P4-11A分析了当代RNA测序数据中的转录本表达和蛋白表达。RNA测序数据分析显示，LILRA5转录本丰度在中性粒细胞和单核细胞之间相当，但在树突状细胞（DC）上水平较低。PE标记的抗LILRA5 P4-11A与来自3名供体的95.58 ± 7.44 %的单核细胞和99.57 ± 0.47 %的中性粒细胞表面结合。进一步分析显示，与IgG1相比，抗LILRA5 P4-11A对单核细胞和中性粒细胞的信号显著更高。值得注意的是，中性粒细胞的表面LILRA5表达低于单核细胞。综上所述，这表明初始中性粒细胞和单核细胞表达相当的LILRA5转录本水平，而单核细胞在其细胞表面表达更高水平的LILRA5蛋白。

2.3 Respiratory Burst Can be Stimulated Through LILRA5

接下来，研究者调查了通过抗LILRA5 P4-11A交联LILRA5是否能诱导中性粒细胞和单核细胞的呼吸爆发。使用抗CD89作为阳性对照，因为它通过交联FcαR（CD89）并诱导FcRγ信号传导来诱导ROS产生。板包被的抗CD89和抗LILRA5 P4-11A（而非同型IgG1对照）导致PBMCs产生ROS。由于LILRA5和FcαRI不在淋巴细胞上表达，ROS产生很可能是通过PBMCs中的单核细胞群体引发的。同样，抗CD89和抗LILRA5 P4-11A（而非同型IgG1对照）在中性粒细胞中诱导了ROS产生。这些数据表明LILRA5可以诱导人类单核细胞和中性粒细胞的呼吸爆发。

2.4 LILRA5 Transcripts Are Elevated in Systemic Infection and Sepsis

由于最近有报道称单核细胞中的LILRA5表达是脓毒症的生物标志物，研究者调查了脓毒症患者中LILRA5转录本和LILRA5蛋白的表达特性。LILRA5表达在多个数据集的脓毒症患者全血中升高。研究者因此质疑中性粒细胞和/或单核细胞是否显示增强的LILRA5表达。与健康对照相比，脓毒症患者的中性粒细胞和单核细胞中LILRA5表达增强。这进一步得到数据集的支持，这些数据集显示危重脓毒症患者循环CD14+单核细胞中的LILRA5转录本水平与健康供体相比显著增强。因此，在人类脓毒症期间，全血、中性粒细胞和单核细胞中的LILRA5表达增加。

为了理解LILRA5表达增强是否是脓毒症标志物，重要的是确定未进展为脓毒症的细菌和病毒感染患者是否显示修饰的LILRA5表达。对Dix等人数据集的分析显示，在确诊为金黄色葡萄球菌或大肠杆菌侵袭性感染的患者全血中，LILRA5表达增加。同样，对Herberg等人数据集的分析显示，与健康对照相比，确诊细菌感染或病毒感染的儿童中LILRA5表达增强。重要的是，对Herwanto等人的分析表明，与健康对照相比，确诊但无并发症感染患者、脓毒症患者和脓毒性休克患者全血中的LILRA5转录本显著增加。这表明脓毒症患者与确诊但无并发症感染患者之间的LILRA5表达没有显著差异，提示全血中LILRA5表达升高本身并不是脓毒症的标志物。

2.5 Surface LILRA5 Expression Does Not Increase Upon Immune Challenge

鉴于在传染性和炎症性疾病期间全血中LILRA5转录本升高，研究者假设在这些条件下免疫细胞上的表面LILRA5表达会增加。先前的转录组分析显示，人类血液离体感染大肠杆菌4小时（而非金黄色葡萄球菌）显著增加了LILRA5表达。为了理解蛋白表达动态，研究者评估了从离体感染大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的全血中纯化的单核细胞上的LILRA5表达。出乎意料的是，表面LILRA5表达没有差异调节。为了理解细菌相互作用细胞相对于非相互作用细胞是否存在表面LILRA5表达改变，研究者使用表达GFP的大肠杆菌或金黄色葡萄球菌进行了实验。值得注意的是，从大肠杆菌感染血液和金黄色葡萄球菌感染全血中回收的GFP阳性细胞与GFP阴性细胞相比，LILRA5表达有增加的趋势。这些数据表明表面LILRA5表达是异质性的，可能受直接细菌相互作用的影响，而不仅仅受血液中细菌整体存在的影响。

为了确定研究者的离体发现是否代表体内免疫挑战，研究者检查了抗LILRA5 P4-11A单克隆抗体与从脓毒症患者和健康对照纯化的PBMCs的结合。脓毒症患者有确诊的革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、念珠菌或未确定病因的感染。研究者通过用APC标记的抗CD14、PE标记的HLA-DR和FITC标记的抗LILRA5共同染色PBMCs，特异性测量了单核细胞上的LILRA5信号。值得注意的是，诊断第一天脓毒症患者单核细胞上的表面LILRA5表达水平与健康对照相比没有显著差异。此外，在个体患者脓毒症进展期间，单核细胞上的表面LILRA5表达基本保持不变。因此，先天免疫细胞中的LILRA5转录本表达在免疫挑战期间增强，但表面LILRA5表达保持不变。

2.6 Soluble LILRA5 Is Elevated in Serum from Sepsis Patients

鉴于先前的观察结果，研究者质疑为什么在系统性感染和炎症期间LILRA5转录本会增加，但表面LILRA5表达水平保持不变。产生编码两种不同sLILRA5亚型的转录本的替代mRNA剪接可以解释这些结果。或者，如果表面LILRA5从细胞表面脱落，也可以解释。在任何一种情况下，sLILRA5水平在免疫挑战下都会升高。为了验证这一点，研究者使用ELISA测定法比较了脓毒症患者和健康供体血清中的sLILRA5。对3名脓毒症患者和3名健康供体血清中sLILRA5浓度的定量显示平均值为22.2 ± 1.6 ng/mL。对更大样本集的测量显示，与健康对照相比，脓毒症患者血清中存在显著更高水平的sLILRA5。综上所述，这表明免疫挑战增加了sLILRA5水平，提示剪接变化或细胞脱落。

2.7 Immune Challenge Impacts LILRA5-Induced ROS Production

为了研究改变的LILRA5转录本或表面LILRA5表达的功能后果，研究者用强效免疫刺激剂LPS挑战PBMCs。LPS诱导单核细胞中LILRA5转录本表达显著增加，并导致表面LILRA5表达增加的趋势。这与LILRA5刺激细胞上清液中sLILRA5量增加相关。鉴于此，研究者测量了当细胞用LPS预刺激时，抗LILRA5 P4-11A诱导ROS产生的能力。对原始ROS产生值的分析未发现LILRA5刺激与LILRA5 + LPS刺激的细胞之间存在任何统计学差异。然而，在将LILRA5/IgG1诱导的ROS产生标准化后，与未处理细胞相比，用LPS刺激的细胞的LILRA5依赖性ROS产生显著减少。这表明LPS挑战增加了LILRA5转录本以及表面和可溶性LILRA5的表达，但LILRA5在诱导呼吸爆发方面效果较差。

为了进一步阐明LPS诱导的表面LILRA5水平改变的功能影响，研究者评估了LILRA5和/或LPS刺激对PBMCs产生细胞因子的影响。研究者发现单独刺激LILRA5不改变TNF-α、IFN-γ或IL-1β的产生，但确实显著减少了IL-6的产生。值得注意的是，LPS挑战显著增加了TNF-α、IL-1β和IL-6细胞因子的产生，但共同刺激LILRA5不显著影响细胞因子产生。综上所述，这些发现表明LPS诱导的LILRA5表达变化并不调节PBMCs中的细胞因子产生。

2.8 A Putative LILRA5 Ligand in Human Serum

除了理解LILRA5表达模式外，识别LILRA5的配体对于确定LILRA5何时驱动有效免疫应答至关重要。由于LILRA5没有已知配体，研究者使用2B4T嵌合NFAT-GFP报告细胞系统测试了人类血清是否含有推定的LILRA5配体。与对照细胞相比，当用健康对照或脓毒症患者的血清培养时，表达LILRA5CD3ζ的细胞显示显著更高百分比的GFP阳性细胞。有趣的是，与健康血清相比，表达LILRA5CD3ζ的细胞中的GFP表达对脓毒症血清的反应显著更高。这些发现提示人类血清中存在LILRA5配体，并且在脓毒症期间潜在配体上调或出现新配体。

3 Discussion

本研究证明人类吞噬细胞表达表面LILRA5，并且它促进ROS产生和脱颗粒的重要效应功能。由于氧化爆发是由感知非我并通过ITAMs发出信号的免疫受体诱导的，研究者的数据暗示LILRA5在启动先天免疫应答中具有作用。在感染或免疫挑战期间，通过LILRA5依赖性机制介导的增强ROS产生将有助于在成功吞噬后杀死吞噬溶酶体中的微生物。确实，删除小鼠中的LILRA5导致铜绿假单胞菌诱导的炎症和角膜炎进展增强。此外，LILRA5触发的颗粒胞吐后，抗菌因子（如蛋白酶和肽）释放到局部环境中将进一步促进微生物杀伤。先前有报道称PBMCs上LILRA5的激活可增强细胞因子产生。然而，研究者未观察到TNF-α、IFN-γ、IL-6或IL-1β产生增加。这可能是由于用于刺激的抗LILRA5单克隆抗体不同，突显了不同LILRA5配体可能发挥不同的生物学功能。

免疫细胞上激活受体的表达水平是其诱导细胞活化能力的重要决定因素。值得注意的是，健康个体循环单核细胞上的表面LILRA5表达显著高于中性粒细胞，尽管LILRA5转录本水平相当。这种差异表达表明LILRA5在单核细胞和中性粒细胞中可能具有 distinct 作用。有趣的是，即使中性粒细胞上表面LILRA5表达较低，研究者的测定证明通过LILRA5交联仍能有效诱导ROS产生。这表明LILRA5虽然在中性粒细胞上丰度较低，但功能完备，能够触发显著的免疫应答。单核细胞表面LILRA5的较高表达可能反映了其在持续免疫激活和调节中更突出的作用，而中性粒细胞上的存在（尽管水平较低）强调了其在快速、急性感染应答中的重要性。

免疫系统启动快速免疫应答以检测非我从而保护宿主。LILRA5表达在转录水平上对感染或免疫挑战的反应上调表明其在感知或启动针对微生物和/或非我的应答中具有作用。一致地，先前有报道称单核细胞中编码膜锚定LILRA5的mRNA是动态的，并在暴露于细胞因子时增加。鉴于此，研究者假设免疫挑战时LILRA5表达增加将与免疫细胞上表面LILRA5表达增加相关。出乎意料的是，本研究揭示在离体细菌病原体感染期间，单核细胞表面LILRA5表达不改变。此外，与健康对照相比，脓毒症患者的单核细胞表面LILRA5表达没有变化。这可以解释为如果增加的LILRA5转录本编码sLILRA5而非膜结合LILRA5。sLILRA5表达在多种免疫细胞类型中报道，并且在个体间差异。一致地，本研究在脓毒症患者血清中检测到sLILRA5，以及在类风湿性关节炎患者的滑液和肝脂肪变性患者血清中。研究者的研究确实发现单核细胞用LPS刺激后表面LILRA5表达有增加的趋势。这些结果表明表面LILRA5表达是动态的，随不同刺激和/或时间而变化。需要进一步研究以阐明表面和可溶性LILRA5表达的确切调控机制，例如使用长读长RNA测序，及其在免疫应答中的功能意义。

激活受体的功能依赖于配体的感知，但LILRA5没有确定的配体。大多数吞噬细胞上的激活受体感知PAMPs、DAMPs、抗体调理的微生物或补体调理的微生物。然而，同一家族中的受体LILRA2可以感知微生物切割的抗体以触发抗菌效应功能。这提出了LILRA5也可能通过检测修饰的自身配体来感知感染的可能性。研究者用报告细胞的测定表明，人类血清中存在推定的LILRA5配体，因为脓毒症患者血清与健康对照相比诱导了升高的LILRA5激活信号。这可能表明配体在脓毒症中丰度增加，或者在脓毒症条件下存在额外的配体。进一步识别LILRA5配体对于推进对其生物学功能的理解至关重要。sLILRA5可能通过竞争相同配体来调节膜锚定LILRA5的功能。

全血或单核细胞中增强的LILRA5表达在患者队列中已被报道为脓毒症的生物标志物。然而，LILRA5转录本在确诊血流感染患者中也增加。此外，全血中的LILRA5转录本水平在确诊但无并发症感染患者与脓毒症患者之间没有显著差异。由于LILRA5转录本水平无法区分这两组患者，这表明LILRA5本身不是脓毒症的生物标志物。研究者对血清中sLILRA5的分析显示，与健康对照相比，脓毒症患者水平升高。需要额外的定量研究来验证这一发现的稳健性，并确定定量血清中的sLILRA5是否是脓毒症的推定生物标志物。

总之，本研究的基础是开发了一种新型靶向LILRA5的单克隆抗体，该抗体以高特异性检测LILRA5并具有激动特性。LILRA5由人类吞噬细胞表达并促进ROS产生。免疫挑战可诱导LILRA5转录本水平动态增加，但表面LILRA5表达不变或增加。这调节了LILRA5依赖性ROS产生。未来的研究需要识别LILRA5配体，并进一步阐明膜结合LILRA5和sLILRA5的调控机制和功能。

4 Data Limitations and Perspectives

研究者承认本研究存在某些局限性。这些包括使用2B4 NFAT-GFP T细胞作为识别受体配体的报告系统。该系统已被证明可有效强制LILR受体通过明确定义的途径和读出信号。然而，这是一个人工系统，因为LILRA5通常与内源性FcRγ关联。未来的研究可以开发基于髓系细胞的LILR报告系统，以提供更生理相关的配体功能评估。此外，研究者对LILRA5表达的分析存在局限性。虽然研究者对整体mRNA的分析揭示了转录本水平的变化，但该分析未捕获由替代剪接产生的不同亚型的表达。采用更先进技术（如长读长RNA测序）的未来研究可以提供对LILRA5转录本的更深入分析，并揭示剪接变体变化的作用。

5 Materials and Methods

（此部分详细描述了实验方法，包括蛋白质表达纯化、抗体生成、流式细胞术、细胞分离、ELISA、报告细胞系构建、ROS测定、转录组数据分析、LPS刺激、全血感染、患者样本分析等具体技术流程和参数，为确保准确性，此处保留其专业细节描述，但鉴于篇幅限制，不在此处全文展开。所有方法均遵循了相关的伦理批准和知情同意原则。）