水痘-带状疱疹病毒特异性细胞免疫应答动力学与潜伏病毒载量的年龄依赖性研究

《Journal of Medical Virology》：Varicella-Zoster Virus-Specific Cell-Mediated Immune Response Kinetics and Latent Viral Load Depending on Aging

本研究采用数字微滴PCR（ddPCR）技术定量健康成人外周血单核细胞中潜伏VZV DNA，结合酶联免疫斑点（ELISPOT）和流式细胞术分析病毒特异性细胞免疫（CMI）。结果揭示VZV-CMI自40岁起显著下降，而潜伏病毒载量从50岁后明显上升，抗体水平则无年龄相关性。ddPCR检测的潜伏病毒负荷或可作为亚临床再激活的生物标志物，为带状疱疹风险分层和疫苗接种策略提供新视角。

　　

引言

水痘-带状疱疹病毒（VZV）是一种嗜神经性α疱疹病毒，原发感染水痘后会在感觉神经节（如背根神经节和颅神经节）建立终身潜伏。当VZV特异性细胞免疫（CMI）因年龄增长或免疫抑制而下降时，潜伏病毒可再激活，引起病毒复制、神经元炎症，最终临床表现为沿皮节分布的疼痛性疱疹性皮疹，即带状疱疹。年龄是带状疱疹的明确风险因素，主要归因于VZV特异性CMI随年龄增长而逐渐衰退。

数字微滴PCR（ddPCR）作为一种高灵敏度技术，可精准定量血液中的潜伏病毒DNA。先前对巨细胞病毒（CMV，同属疱疹病毒科）的研究表明，免疫正常个体外周血单核细胞（PBMCs）中潜伏CMV病毒载量随年龄增加而上升，提示年龄相关的CMV特异性T细胞免疫下降可能导致潜伏病毒负荷增加。类似地，VZV潜伏于背根神经节（DRG），但直接采样DRG组织因解剖位置困难。既往研究报道，由于VZV的T细胞嗜性，PBMCs中可检测到低水平VZV DNA。

本研究假设ddPCR可作为检测VZV亚临床再激活和定量潜伏病毒负荷的新工具，旨在通过ddPCR定量血液中潜伏VZV滴度、评估VZV特异性T细胞应答及测量不同年龄组健康个体的VZV特异性IgG水平，寻找预测带状疱疹风险的潜在生物标志物。

材料与方法

患者与研究设计

本研究于2024年2月至4月前瞻性纳入40–80岁健康成人，每个年龄组（40–49岁、50–59岁、60–69岁、70–79岁）各20名参与者。排除标准包括自身免疫性疾病、免疫抑制状态、糖尿病、恶性肿瘤、慢性疼痛、近期手术史（3个月内）、当前使用精神类药物或有心肌梗死/卒中史。高血压不作为排除标准，因其为常见合并症且对VZV特异性免疫应答影响不大。所有参与者均进行VZV特异性IFN-γ ELISPOT检测、ddPCR潜伏VZV DNA定量和ELISA抗体应答检测。另从每组随机选5人进行流式细胞术胞内因子染色评估VZV特异性多功能T细胞应答。

酶联免疫斑点（ELISPOT）检测

为评估VZV特异性CMI，采用IFN-γ ELISPOT法分析PBMCs。外周血采集于EDTA抗凝管，PBMCs通过密度梯度离心分离后液氮冻存。检测时，PBMCs重悬于含5%胎牛血清的RPMI1640培养基，浓度2.0×10⁶ cells/mL。样品在预包被抗人IFN-γ的板中与VZV裂解抗原、MRC-5对照抗原及PMA/离子霉素共孵育24小时，自动ELISPOT板读数仪计数斑点，结果以每10⁶个PBMCs的斑点形成单位（SFU）表示。

VZV特异性多功能T细胞应答

通过胞内因子染色评估CMI多功能性。冻存PBMCs快速复苏洗涤后静置2小时，以MRC-5裂解物（阴性对照）、VZV感染细胞裂解物或PMA/离子霉素（阳性对照）刺激。培养1小时后加入布雷菲德菌素A和莫能菌素，继续培养4小时。细胞先后用Live/Dead近红外死细胞染料、抗CD3-BV510、抗CD4-BV786、抗CD8-R718、抗CD14-APC-H7和抗CD19-APC-H7表面染色，固定破膜后加入抗IFN-γ-FITC、抗IL-2-PE和抗TNF-α进行胞内染色。数据用BD FACSymphony A3流式细胞仪获取，FlowJo软件分析，布尔门控分析多功能性，SPICE软件可视化。

数字微滴PCR（ddPCR）

为定量PBMCs中潜伏VZV DNA，从5×10⁵个PBMCs提取总DNA。针对VZV ORF62设计引物探针，同时定量人RNase P亚基30（RPP30）以标准化病毒拷贝数。将70 μL微滴生成油和20 μL反应混合物（含5 μL DNA样本、3 μL PCR级水、2× ddPCR supermix、2 μL引物探针混合液）加至微滴生成卡，用QX200微滴生成仪生成微滴。PCR条件：95°C 10分钟，随后94°C 30秒、60°C 1分钟共50循环，98°C 10分钟。数据用QX200微滴读取仪获取，QuantaSoft软件分析，标准化潜伏VZV病毒载量以每10⁵个PBMCs的VZV拷贝数表示。检测下限1拷贝/μL，线性范围5–10⁵拷贝/μL。

血清学检测

血浆样本-80°C冻存至分析。采用商业ELISA试剂盒检测VZV IgG，按说明书操作，SpectraMax 190酶标仪读取数据。

统计分析

分类变量比较用Fisher精确或χ2检验，连续变量用非配对t检验、Mann–Whitney U检验或Kruskal–Wallis检验。Kruskal–Wallis检验有显著差异时，用Dunn事后检验及Holm–Bonferroni校正。相关性分析用Pearson或Spearman相关系数（依数据正态性）。简单线性回归评估变量关系，所有检验均为双侧，p<0.05认为有统计学意义。使用GraphPad Prism 10.4.1进行统计分析。

伦理批准

本研究经议政府义慈医疗中心机构审查委员会批准（IRB号2024-01-005-001），所有参与者入组前签署知情同意书，数据匿名化编码安全存储。

结果

患者特征

各年龄组中位年龄分别为43岁（40–49岁组）、53岁（50–59岁组）、64岁（60–69岁组）和74岁（70–79岁组）。80名参与者中女性56名（70%），40–49岁组男性比例最高（50%）。带状疱疹病史在70–79岁组最普遍（30%），60–69岁组最低（10%）。带状疱疹疫苗接种率在40–49岁组为0%，50–59岁和60–69岁组各25%，70–79岁组15%。

VZV特异性T细胞应答

80名参与者VZV特异性CMI中位值116.5 SFU/10⁶ PBMCs（IQR 56.75–237.25）。40多岁组中位值最高（128, IQR 63–164.8），50多岁组次之（116.5, IQR 70.75–154.3），60多岁组（81.5, IQR 16.25–132.3）和70多岁组（55.5, IQR 28–89.3）显著降低。VZV-CMI随年龄显著下降（r=?0.356, p=0.001）。组间比较显示70多岁组应答低于40多岁组（p=0.029）和50多岁组（p=0.068），提示年龄相关差异主要源于高龄组CMI下降。

VZV特异性多功能T细胞应答

随年龄增长，CD4⁺ T细胞多功能性（产生≥2种细胞因子）有增加趋势，其中IFN-γ⁺IL-2⁺TNF-α⁺ CD4⁺和IFN-γ⁺IL-2⁺TNF-α^? CD4⁺亚群频率与年龄显著相关（p=0.040, p=0.023）。相比之下，CD8⁺ T细胞的双阳性（2⁺）和三阳性（3⁺）细胞比例低于CD4⁺ T细胞，且与年龄无显著相关（所有p>0.05）。多功能T细胞亚群与ELISPOT读数无相关性（p>0.05）。潜伏VZV DNA载量与特定多功能群体——IFN-γ⁺IL-2⁺TNF-α⁺ CD4⁺和IFN-γ⁺IL-2^?TNF-α⁺ CD8⁺ T细胞相关（p=0.002, p=0.035）。在CD3、CD4、CD8 T细胞中设门分析IFN-γ⁺事件，各年龄组间无显著下降，但排除40多岁组后，IFN-γ⁺ CD3⁺和IFN-γ⁺ CD4⁺ T细胞频率随年龄有下降趋势（r=?0.438, p=0.104; r=?0.442, p=0.100），而IFN-γ⁺ CD8⁺ T细胞无显著关联（p=0.562）。

PBMCs中潜伏VZV负荷

80名参与者中25名（31%）检测到VZV DNA，中位潜伏VZV DNA为8.57 log拷贝/10⁵ PBMCs（IQR 5.82–21.47）。潜伏VZV载量随年龄有增加趋势但未达统计学显著性。限制分析50–79岁个体时，年龄与潜伏VZV负荷呈显著正相关（r=0.459, p<0.001）。全人群VZV特异性CMI与潜伏VZV载量无显著相关（r=0.004, p=0.967）。ddPCR阳性个体VZV特异性CMI倾向于低于阴性组，但差异不显著（p=0.095）。

VZV特异性抗体应答

各年龄组VZV特异性抗体滴度中位值分别为40多岁组561.7 IU/mL（IQR 329.7–957.8）、50多岁组1140 IU/mL（IQR 566.8–3310）、60多岁组547.6 IU/mL（IQR 282.8–890.2）、70多岁组743.1 IU/mL（IQR 460.3–1178）。年龄与VZV特异性抗体水平无显著关联。

亚组分析

排除有带状疱疹病史或接种疫苗者后，VZV特异性T细胞应答、潜伏病毒DNA水平和抗体滴度的总体趋势不变，T细胞应答与年龄的负相关持续（r=?0.399, p=0.003），而潜伏病毒DNA（r=0.051, p=0.716）和抗体滴度（r=0.066, p=0.638）仍与年龄无显著相关。性别分层分析显示，女性亚组（占队列70%）中VZV特异性T细胞应答随年龄下降（r=?0.329; p=0.013），抗体应答与年龄无关（r=?0.118; p=0.386），潜伏VZV DNA载量从40多岁起随年龄增加（r=0.296; p=0.027）。男性亚组中则未检测到T细胞应答、潜伏病毒载量或抗体应答的显著年龄相关性（所有p>0.05）。

讨论

本研究探讨了VZV特异性CMI和PBMCs中潜伏VZV负荷的年龄相关性变化，证实VZV特异性T细胞免疫随年龄显著下降，支持衰老是带状疱疹关键风险因素的观点。潜伏VZV负荷在50岁及以上个体中与年龄呈显著正相关，提示VZV特异性T细胞应答下降可能导致高龄者潜伏病毒持续和潜在再激活的检测增加。

ddPCR作为一种超灵敏定量PCR技术，无需标准曲线即可绝对定量低拷贝病毒DNA，通过将样本分割为数千纳升微滴实现稀有病毒DNA分子精准检测，已广泛应用于低水平病毒持续存在、亚临床再激活及HIV、CMV、HBV、SARS-CoV-2等病毒的载量监测。本研究首次将ddPCR用于VZV检测，发现约30%健康成人外周血中存在可检测水平的潜伏VZV。

多项研究证实VZV特异性T细胞应答随衰老下降，尤其60岁后IFN-γ产生T细胞减少与带状疱疹再激活风险增加相关。本研究与此一致，T细胞应答下降在60岁后最明显，与高龄带状疱疹发病率升高吻合。尽管发现T细胞应答与年龄显著负相关，但各年龄组内个体间变异较大，可能反映自然感染、疫苗接种或既往亚临床再激活塑造的个体免疫记忆差异，或与ELISPOT本身变异有关。组间统计比较显示70多岁组应答显著低于40多岁组，支持CMI年龄相关性下降，但广泛变异提示需更大样本研究并考虑个体免疫史。

有限数据显示，CD4⁺ T细胞多功能性（≥2种细胞因子）随年龄保留，且IFN-γ⁺IL-2⁺TNF-α⁺和IFN-γ⁺IL-2⁺TNF-α^? CD4⁺亚群随年龄上升（p<0.05）。相反，CD8⁺双/三阳性细胞少见且无年龄关联，此模式与VZV裂解物主要通过MHC II类递呈的CD4偏向性及可能耗竭/衰老一致。值得注意的是，多功能亚群与ELISPOT读数不相关。为厘清此差异，直接分析CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺区室中IFN-γ⁺应答发现，所有年龄组一起分析时无随年龄下降趋势，排除40多岁组后IFN-γ⁺ CD3⁺和CD4⁺ T细胞频率有下降倾向（未达显著），而CD8⁺ T细胞无变化，提示ELISPOT应答的年龄相关性下降可能部分由CD4⁺ T细胞IFN-γ产生减少解释。此外，潜伏VZV DNA载量与IFN-γ⁺IL-2⁺TNF-α⁺ CD4⁺和IFN-γ⁺IL-2^?TNF-α⁺ CD8⁺群体相关（p<0.05），提示潜伏VZV反复暴露可能引起记忆膨胀，类似CMV中衰老伴随记忆/TEMRA细胞扩增且多功能性增加。需结合免疫耗竭和衰老标志物的表型功能谱深入探讨VZV特异性T细胞应答在抗再激活免疫保护中的贡献。

本研究提示潜伏VZV DNA水平与年龄相关免疫下降可能存在关联。随衰老VZV特异性T细胞免疫衰退，潜伏病毒载量增加。50多岁前T细胞功能相对保存可控制亚临床再激活，临床病例较少；高龄者病毒载量急剧上升且T细胞控制受损可能导致临床带状疱疹。单点定量测量因T细胞应答变异性常不可靠，但趋势或定性分析可提供信息。此背景下，变异更低、灵敏度更高的数字PCR作为单次测量指标，或可成为更客观可靠的带状疱疹风险生物标志物，助力基于生物标志物而非年龄的带状疱疹疫苗接种。ddPCR检测血液中低水平VZV复制的能力表明其或可作为高危个体症状性再激活的无创早期检测方法，但其预测带状疱疹风险的效用仍属推测，需前瞻性纵向研究结合临床终点验证预测效力和临床实用性。

本研究中ddPCR检测的潜伏VZV负荷在40多岁组相对较高，50岁后显著上升，原因未明。或与疫苗接种、自然感染获得的水痘免疫力差异有关，但未收集个体水痘疫苗接种或早年感染数据，此解释仍属假设需进一步研究。40多岁个体潜伏VZV可能来自Oka株和野生株，而50岁以上可能仅潜伏野生株VZV，不同毒株潜伏病毒载量动力学可能随年龄各异，需更多研究。

与CMI和潜伏病毒载量不同，体液免疫在各年龄组相对稳定。血清流行率研究显示超90%成人VZV血清阳性，表明VZV特异性体液免疫持久，但抗体质量（如持久性和功能容量）可能随年龄下降。本研究中VZV抗体应答无随年龄显著下降，提示CMI下降及相关潜伏VZV病毒载量上升（而非体液免疫）在高龄带状疱疹易感性中起主导作用。

本研究存在一定局限：样本量较小（每组20人，共80人），可能限制结果普适性；队列仅含40岁及以上个体，未能捕捉VZV特异性免疫年龄相关变化的早期轨迹；所有参与者来自单一国家，免疫背景相对统一，水痘暴露、自然感染率、水痘疫苗接种时间或类型差异可能影响免疫记忆和潜伏病毒负荷，需纳入更年轻组别和多样人群验证结果。但本研究首次同步评估健康成人VZV特异性CMI、亚临床再激活和体液免疫，全面方法为VZV潜伏和再激活免疫机制提供宝贵见解，或为未来预测带状疱疹风险和建立证据基础带状疱疹疫苗接种策略奠定基础。

结论

本研究深入揭示VZV免疫的年龄动力学，表明VZV特异性CMI随年龄下降，而潜伏VZV负荷尤其50岁后上升趋势明显。ddPCR定量潜伏VZV DNA或可作为检测亚临床再激活的有用工具，有潜力成为带状疱疹风险分层生物标志物，但此解释仍假设性，需结合临床终点的前瞻纵向研究确立其预测和临床价值。

利益冲突

作者声明无利益冲突。