靶向长读长测序技术TIP在植物细胞器RNA编辑与剪接变异分析中的应用与创新

《Plant Direct》：Rapid and Cost-Effective Digital Quantification of RNA Editing and Maturation in Organelle Transcripts by Oxford Nanopore Target-Indexed-PCR (TIP) Sequencing

本文开发了一种名为TIP测序的新型长读长测序方法，通过牛津纳米孔技术实现了对叶绿体ndhB和ndhD转录本中C-to-U RNA编辑效率和剪接变异的数字化定量。该方法结合高保真PCR与定制生物信息学流程，证实MORF2基因的表达水平以剂量依赖方式调控RNA编辑，并首次发现其影响ndhB群组II内含子的剪接效率。该技术为植物细胞器RNA代谢研究提供了高精度、低成本的分析平台。

　　

技术瓶颈与创新突破

传统RNA编辑效率定量方法存在明显局限性：桑格测序分辨率低且重复性差，而新一代测序技术流程复杂、成本高昂。为解决这一技术瓶颈，本研究开发了靶向长读长测序技术，通过牛津纳米孔平台实现了对叶绿体ndhB和ndhD转录本中RNA编辑事件的单分子级数字化定量。

TIP测序技术的工作流程

该技术核心流程包括：首先使用带独特索引的引物扩增目标基因全长编码区，随后通过纳米孔测序获得长读长序列数据。关键创新在于开发了定制生物信息学流程，包含条形码拆分、链定向校正、伪基因组比对等模块。特别设计的伪基因组包含6条合成染色体，分别对应索引化的ndhB和ndhD序列，确保精准比对。

MORF2剂量依赖性调控机制的验证

应用TIP测序技术分析iCRISPRi介导的MORF2基因沉默模型，发现在强抑制系P1-12中，ndhB的9个编辑位点中有6个、ndhD的5个编辑位点中有2个呈现显著编辑效率下降。而在弱抑制系P1-10中未观察到显著变化，证明MORF2对RNA编辑的调控具有明确的剂量阈值效应。

剪接变异体的意外发现

测序数据中检测到高分子量ndhB扩增产物，经分析确认为保留685bp群组II内含子的未剪接前体转录本。在MORF2过表达或共抑制的成年莲座叶中，未剪接ndhB变异体频率显著升高，提示MORF2通过其分子伴侣活性参与RNA剪接过程的协调。

技术优势与应用前景

与传统方法相比，TIP测序每次反应成本仅需30美元，且支持多重样本索引。技术重复性验证显示，不同生物学重复间编辑效率标准差低于6%，显著优于桑格测序。该方法为植物细胞器RNA编辑、剪接动力学及应激响应研究提供了高效平台，特别适用于靶向基因的跨基因型比较研究。

生物信息学工具的开放性

本研究开发的Perl和Python脚本已开源共享，包含逐步使用指南。这些轻量级工具模块支持从原始数据到编辑效率分析的完整流程，显著降低了植物RNA代谢研究的计算门槛。