针对土拉弗朗西斯菌毒力因子的高亲和力迷你蛋白结合剂的重新设计

《ANGEWANDTE CHEMIE-INTERNATIONAL EDITION》：De Novo Design of High-Affinity Miniprotein Binders Targeting Francisella Tularensis Virulence Factor

Francisella tularensis的 Francisella-like lipoprotein (Flpp3)作为关键毒力因子，其靶向结合器设计通过物理基础与深度学习结合，成功开发了作用于Flpp3两个不同位点的微型蛋白结合器。α位点设计了四个结合器（ASD1-4），结合亲和力达24-110 nM，β位点原始设计者BSD1亲和力81 nM，经位点饱和突变体筛选后优化至580 pM。X射线晶体结构证实ASD1-Flpp3复合物结构（Cα RMSD 0.9 ?）与设计模型高度吻合，CD光谱验证了微型蛋白的热稳定性与拓扑结构。研究成果为新型治疗开发提供了工具，并揭示了Flpp3在免疫逃逸和细菌扩散中的分子机制。

　　近年来，随着生物技术的迅速发展，科学家们在设计高亲和力的蛋白质结合剂方面取得了重要进展。这些结合剂在靶向细菌致病因子方面展现出巨大潜力，尤其在应对如“兔热病”（tularemia）这类由高度传染性病原体引起的疾病时。本文报道了一种结合物理基础计算方法与深度学习技术的创新设计策略，用于开发针对*Francisella tularensis*（兔热病菌）的关键致病因子——Francisella-like lipoprotein（Flpp3）的高亲和力迷你蛋白结合剂。这些迷你蛋白结合剂不仅有助于深入理解Flpp3在感染过程中的作用，还为开发新型治疗手段提供了重要的研究工具。

### Flpp3的功能与重要性

Flpp3是*F. tularensis*的外膜脂蛋白，具有重要的致病功能。它在细菌的感染过程中扮演关键角色，尤其是在逃避免疫系统的识别和传播方面。研究表明，Flpp3能够干扰宿主的免疫反应，例如通过TLR2依赖机制延长中性粒细胞的寿命，从而抑制凋亡过程，进而促进组织损伤和细菌扩散。此外，Flpp3还能够与血浆纤溶酶原结合，促进细胞外基质的降解，有助于细菌在宿主体内广泛传播。尽管Flpp3的某些功能已经被研究，但其在细胞内的定位、与其他蛋白的相互作用以及对致病性的具体贡献仍然不够清晰。

由于其高感染性和潜在的生物恐怖主义威胁，*F. tularensis*被美国疾病控制与预防中心（CDC）列为第一级选择性病原体和A类生物恐怖主义病原体。目前，虽然兔热病可以通过抗生素治疗，如氟喹诺酮类、氨基糖苷类和四环素类药物，但随着抗生素耐药性的出现，开发新的医疗应对措施变得尤为重要。因此，针对Flpp3的靶向治疗策略成为研究热点。

### Flpp3结构的挑战

尽管Flpp3的结构已被X射线自由电子激光（XFEL）和核磁共振（NMR）技术解析，但其靶向设计仍然面临诸多挑战。首先，Flpp3尚未有明确的结合伴侣被鉴定，而这些结合伴侣通常是设计新治疗候选药物的基础。其次，Flpp3表面缺乏深口袋，这使得小分子药物的结合变得困难。虽然NMR结构显示其内部存在一个可能的小分子结合腔，但这一腔在XFEL结构中并未被观察到。此外，Flpp3的结构灵活性也增加了结构导向设计的难度。

为了克服这些挑战，研究团队采用了一种结合物理基础计算方法和深度学习（DL）技术的全新设计策略。该方法基于*de novo*（从头开始）设计思路，利用计算模型生成具有不同形状和大小的迷你蛋白结合剂，并通过实验筛选和优化，最终获得具有高亲和力的结合分子。

### 计算设计流程

研究团队首先使用了*F. tularensis*可溶性域的结构（PDB ID: 6PNY），该结构由六个β片层和两个α螺旋组成。由于Flpp3的结构与功能之间的关系尚未完全阐明，研究者决定针对其结构的两个面进行结合剂设计。其中，α螺旋主导的面被定义为“α位点”（site I），假设其与外膜的内层相互作用；而由β片层形成的相对平坦的面被定义为“β位点”（site II）。通过结合物理计算方法和深度学习模型，研究团队设计了多个结合剂，并进行了多轮筛选和优化。

具体而言，研究采用了三个主要步骤的计算设计流程：首先是利用Rosetta的Rotamer Interaction Field Docking（RIFDock）方法，从预枚举的迷你蛋白骨架库中筛选出可能与Flpp3形成有利相互作用的结合剂。随后，使用ProteinMPNN这一基于深度学习的工具，对筛选出的骨架进行序列设计，以提高其与Flpp3的结构和化学互补性。最后，通过AlphaFold2和Rosetta等工具对设计的结合剂结构进行预测和过滤，以确保其具有良好的折叠能力和结合能力。

通过上述计算流程，研究团队最终筛选出150,000个可能的结合剂模型，并进一步实验验证其中的15000个α位点设计和8817个β位点设计。实验结果显示，α位点结合剂在1 nM的Flpp3浓度下仍能显示出显著的结合信号，而β位点结合剂则需要更高的浓度（如30 nM）才能检测到结合。

### 实验筛选与优化

为了验证这些计算设计的结合剂，研究团队采用酵母表面展示（YSD）技术结合流式细胞术（FACS）进行筛选。通过将设计的结合剂基因克隆到酵母表达载体中，并在酵母细胞表面展示，研究者能够观察到结合剂与Flpp3的结合情况。此外，还使用生物层干涉技术（BLI）和表面等离子共振（SPR）测定结合亲和力。结果显示，α位点结合剂的结合亲和力范围在24–110 nM之间，其中ASD1的结合亲和力达到24 nM，为目前最优的结合剂。对于β位点结合剂，原始设计BSD1的结合亲和力为81 nM，但经过位点饱和突变（SSM）优化后，某些变体的结合亲和力甚至低于1 nM，其中最优变体BSD1.18的结合亲和力达到580 pM。

这些结合剂不仅表现出良好的结合能力，还通过圆二色光谱（CD）验证了其折叠结构，表明它们能够形成设计中的全螺旋结构。此外，X射线晶体结构分析进一步确认了ASD1与Flpp3的结合模式，其Cα根均方偏差（RMSD）仅为0.9 ?，显示出极高的结构一致性。这一结果表明，结合物理计算和深度学习的计算方法能够以原子级精度设计高亲和力的结合剂。

### 结合剂的结构与功能分析

研究团队进一步分析了这些结合剂的结构特征和结合机制。以ASD1为例，其与Flpp3的结合主要通过两个螺旋（H2和H3）与Flpp3的α位点形成疏水和极性相互作用。ASD1的Leu25、Ala28、Leu33、Tyr44、Leu47和Ala51等残基通过疏水作用与Flpp3的互补区域结合，而Tyr29和Leu25则通过极性相互作用与Flpp3的Ser151和Glu158形成稳定结合。此外，Tyr44和Asn39还通过氢键与Flpp3的Gln88相互作用，进一步稳定了结合界面。

值得注意的是，虽然这些结合剂在实验中表现出良好的结合能力，但在流式细胞术实验中未能检测到其在完整细菌细胞表面的结合信号。这可能意味着Flpp3在完整细胞中并非暴露于细胞表面，而是定位在外膜的内层或嵌入在更大的蛋白复合物中。这一发现表明，尽管这些结合剂在体外表现出高亲和力，但在实际应用中可能需要进一步研究其在细胞内的定位和作用机制。

### 应用前景与未来方向

这些高亲和力的迷你蛋白结合剂不仅为研究Flpp3的功能提供了有力工具，还为开发针对兔热病的新型治疗策略奠定了基础。它们可以用于干扰Flpp3的免疫逃逸功能，从而抑制细菌的感染和传播。此外，这些结合剂的高特异性和亲和力使其成为研究外膜蛋白定位和相互作用的潜在分子探针。

未来的研究方向包括进一步优化这些结合剂，探索其在感染和免疫逃逸中的具体机制，并评估其作为治疗药物的潜力。同时，研究团队也指出，由于Flpp3可能被外膜上的脂多糖（LPS）屏障或外膜胶囊所限制，设计具有更强穿透能力的小分子或肽类药物可能更为有效。此外，研究团队还建议通过免疫共沉淀或荧光显微镜等技术，进一步研究Flpp3在完整细胞中的定位和相互作用。

### 总结

综上所述，这项研究展示了结合物理计算与深度学习技术在设计高亲和力蛋白质结合剂方面的强大能力。通过这一方法，研究者成功开发了针对Flpp3的多个结合剂，并通过实验验证了其结构和功能特性。这些结合剂不仅为理解Flpp3在兔热病中的作用提供了新的视角，也为开发新型治疗策略提供了重要的分子工具。随着计算方法的不断进步和实验技术的优化，未来的药物设计有望在更大范围内实现精准靶向，为对抗高危病原体提供新的解决方案。