靶向EBV相关恶性肿瘤的LMP2A特异性CAR-T和iIL-18 TRUCKs的开发与功能表征

《HLA》：LMP2A-Targeting CAR-T Cells Equipped With Inducible IL-18 to Address EBV-Associated Malignancies

本文推荐：研究者成功开发了靶向EBV潜伏膜蛋白2A（LMP2A）衍生肽（CLGGLLTMV）/HLA-A*02:01（A02_CLG）复合物的T细胞受体样嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）及其可诱导表达细胞因子（TRUCK）变体。这些工程化T细胞（特别是可诱导表达IL-18的LMP2A_iIL-18_TRUCKs）在体外展现出对表达A02_CLG表位的靶细胞的高度特异性激活、细胞因子释放和细胞毒性，且无脱靶效应，为治疗爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）相关移植后淋巴组织增殖性疾病（PTLD）、霍奇金淋巴瘤（HL）等恶性肿瘤提供了具有前景的新型细胞免疫治疗策略。

　　

1 引言

爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）是一种广泛传播的γ疱疹病毒，与多种淋巴增殖性疾病和恶性肿瘤的发生密切相关，包括移植后淋巴组织增殖性疾病（PTLD）、霍奇金淋巴瘤（HL）、鼻咽癌（NPC）以及某些类型的非霍奇金淋巴瘤（NHL）。EBV在感染细胞中可建立不同的潜伏感染程序（潜伏期I、II、III型），其中潜伏期III型和II型与多种EBV相关恶性肿瘤有关，并表达一组有限的病毒蛋白，包括EBV核抗原（EBNA）和潜伏膜蛋白（LMP）。LMP2A是其中一个重要的病毒蛋白，其衍生肽（如CLGGLLTMV, 简称CLG）可与人类白细胞抗原HLA-A*02:01（A02）结合形成复合物（A02_CLG），为特异性免疫治疗提供了理想的靶点。目前针对EBV相关恶性肿瘤的标准治疗（如化疗、放疗）往往伴随严重副作用，且不能特异性清除EBV感染的恶性细胞。虽然过继性输注EBV特异性记忆T细胞在治疗PTLD中显示出疗效，但其应用受限于需要HLA匹配的合适供体以及足够的病毒特异性T细胞数量。因此，开发一种不依赖供体、且能高效特异性靶向EBV感染细胞的通用型细胞疗法具有重要的临床意义。

嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法在血液肿瘤治疗中取得了革命性成功。通过将识别肿瘤相关抗原的单链抗体片段（scFv）与T细胞激活信号域融合，CAR能够引导T细胞特异性杀伤表达相应抗原的靶细胞。然而，针对EBV相关恶性肿瘤的CAR-T疗法开发仍面临挑战，部分原因在于缺乏在肿瘤细胞上高表达且特异性良好的细胞表面靶点。利用能够识别MHC-肽复合物的T细胞受体（TCR）样抗体构建的CAR（TCR-like CAR），为靶向细胞内抗原（如病毒蛋白或癌睾抗原）提供了新策略。

此外，EBV感染的恶性细胞能够通过多种机制逃避免疫监视，例如创造免疫抑制性的肿瘤微环境（TME）。为了增强CAR-T细胞在免疫抑制环境中的疗效并招募旁观者免疫细胞，研究人员开发了“装甲”CAR-T细胞，例如可诱导表达细胞因子的TRUCKs（T cells redirected for universal cytokine-mediated killing）。其中，可诱导表达白细胞介素12（IL-12）或白细胞介素18（IL-18）的TRUCKs被证明能够重塑TME，增强抗肿瘤免疫力。

本研究旨在开发靶向LMP2A衍生A02_CLG表位的TCR-like CAR-T细胞（LMP2A_CAR-Ts），并进一步构建可诱导表达IL-12（LMP2A_iIL-12_TRUCKs）或IL-18（LMP2A_iIL-18_TRUCKs）的TRUCK变体，系统评估其在体外对表达A02_CLG表位的靶细胞的特异性识别、激活、细胞因子释放及细胞毒性功能，为治疗EBV相关恶性肿瘤提供新的候选细胞治疗产品。

2 材料与方法

2.1 载体构建

研究团队构建了多种慢病毒载体。基础载体编码一个靶向LMP2A_426-434 (CLGGLLTMV) 肽/HLA-A*02:01复合物的scFv（源自克隆8），该scFv通过铰链区和跨膜区与CD28和CD3ζ胞内信号域相连，构成第二代CAR。此外，CAR序列后通过自切割P2A肽与截短的表皮生长因子受体（EGFRt）融合，作为转导细胞的检测和筛选标记。在此基础上，分别构建了三种TRUCK载体：LMP2A_iEGFP_TRUCK（含增强型绿色荧光蛋白EGFP作为报告基因）、LMP2A_iIL-12_TRUCK（含小鼠IL-12 p35和p40亚基）和LMP2A_iIL-18_TRUCK（含人IL-18前体蛋白cDNA）。这些TRUCK载体在CAR表达框之后，包含了由核因子激活的T细胞（NFAT）反应元件驱动的可诱导表达盒，旨在CAR激活后特异性表达相应的转基因。

2.2 细胞系

实验使用了多种人类细胞系作为靶细胞模型。T2细胞（运输相关抗原处理缺陷型）用于肽加载实验，通过将LMP2A衍生肽CLG或无关对照肽SLL加载到细胞表面的HLA-A02:01分子上，形成T2_CLG或T2_SLL靶细胞。SPI-801细胞（HLA-I类分子阴性）及其经慢病毒转导表达HLA-A02:01（SPI_A02）或HLA-A01:01（SPI_A01）的衍生细胞系也被用于类似处理，生成SPI_A02_CLG、SPI_A02_SLL、SPI_A01_CLG等靶细胞。此外，还使用了CRISPR/Cas9技术敲除T2细胞中的HLA-A02:01基因（T2^A02ko），并加载CLG肽（T2^A02ko_CLG），以验证HLA限制性。EB病毒转化的B淋巴母细胞样细胞系（B-LCLs）来自健康供者，用于验证CAR对天然EBV感染细胞的识别。报告细胞系NFAT-luc/NF-κB-luc Jurkat用于评估CAR的信号传导活性。

2.3 T细胞分离、转导与扩增

从健康志愿者外周血单核细胞（PBMCs）中分离CD8⁺ T细胞。使用抗CD3/CD28磁珠和细胞因子（IL-7和IL-15）刺激T细胞后进行慢病毒转导，以递送上述CAR或TRUCK构建体。转导后，通过基于生物素化抗-EGFRt抗体和链霉亲和素微珠的磁激活细胞分选（MACS）富集EGFRt⁺的工程化T细胞，并获得高纯度（>99%）的CAR-T或TRUCK细胞群体。细胞在体外按类似临床生产方案进行扩增。

2.4 表型与功能分析

通过流式细胞术分析工程化T细胞在扩增过程中的记忆表型（初始T细胞 T_N、干细胞样记忆T细胞 T_SCM、中央记忆T细胞 T_CM、效应记忆T细胞 T_EM、效应T细胞 T_EF）、激活标记（如CD25, CD137）、衰竭标记（如PD-1, LAG-3, TIM-3）以及细胞内CAR表达（通过抗-idiotype G₄S抗体染色）。通过将工程化T细胞与不同靶细胞共培养，评估其特异性激活（通过CD25, CD137, FasL表达上调）、可诱导转基因的表达（EGFP, IL-12, IL-18）以及细胞因子的释放（使用基于微球的流式细胞因子多重检测技术分析IFN-γ, TNF-α, 颗粒酶B, 穿孔素等）。通过7-氨基放线菌素D（7-AAD）染色检测羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）或细胞示踪染料（CellTrace Violet, CTV）标记的靶细胞活力来评估细胞毒性。同时使用乳酸脱氢酶（LDH）释放实验和实时细胞分析（xCELLigence RTCA）系统进一步验证和动态监测杀伤动力学。

2.5 统计学分析

实验数据以均值±标准差（SD）表示。使用GraphPad Prism软件进行统计学分析，组间比较采用双向方差分析（ANOVA）结合Tukey多重比较检验，或Mann-Whitney U检验。p值≤0.05认为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 LMP2A_CAR构建体特异性识别A02⁺EBV⁺或A02_CLG⁺靶细胞并激活下游信号

首先，研究团队在报告细胞系中验证了构建的LMP2A_CAR（含或不含可诱导表达盒）的功能。结果表明，所有LMP2A_CAR构建体在与HLA-A02:01⁺的EBV转化B-LCLs（B淋巴母细胞样细胞系）共培养时，均能特异性诱导NF-κB和NFAT转录活性，而与HLA-A02:01^-的B-LCLs、EBV阴性B细胞或外周血单个核细胞（PBMCs）共培养时则无此反应。同样，在与表达A02_CLG复合物的工程化靶细胞（如SPI_A02_CLG）共培养时，也观察到了强烈的NFAT和NF-κB活性。这些结果证实了LMP2A_CAR构建体能够特异性识别A02_CLG表位，并有效启动下游T细胞激活信号通路。

3.2 LMP2A_CAR-Ts、LMP2A_iEGFP_TRUCKs和LMP2A_iIL-18_TRUCKs具有有利的表型，激活和衰竭水平低

将构建体转导至健康供者来源的CD8⁺ T细胞后，成功获得了高纯度的LMP2A_CAR-Ts和TRUCKs。在体外扩增过程中，LMP2A_CAR-Ts、LMP2A_iEGFP_TRUCKs和LMP2A_iIL-18_TRUCKs表现出以干细胞样记忆T细胞（T_SCM）和效应记忆T细胞（T_EM）为主的有利记忆表型，激活标记（如CD25, CD137）在扩增后期回落，衰竭标记（如PD-1, LAG-3, TIM-3）的表达水平也较低。相比之下，LMP2A_iIL-12_TRUCKs在扩增过程中表现出明显的表型改变，其记忆表型主要向T_EM细胞偏移，T_SCM细胞比例极低，并且LAG-3、TIM-3和CD39等衰竭相关标记的表达显著升高。对培养上清液的细胞因子检测发现，LMP2A_iIL-12_TRUCKs在扩增早期（可能由于抗CD3/CD28磁珠刺激诱导了NFAT活性）即释放较高水平的IL-12，而LMP2A_iIL-18_TRUCKs释放的IL-18水平则低得多。LMP2A_CAR-Ts和LMP2A_iEGFP_TRUCKs则不释放IL-12或IL-18。这些结果表明，LMP2A_iIL-12_TRUCKs在制备过程中因IL-12的泄漏表达而发生了分化状态、炎症因子释放和衰竭标记表达方面的改变，而LMP2A_CAR-Ts和LMP2A_iIL-18_TRUCKs则保持了更“年轻”和更少衰竭的表型。

3.3 LMP2A_TRUCKs在靶标识别后特异性激活可诱导表达盒

功能验证实验表明，当LMP2A_iEGFP_TRUCKs与A02_CLG⁺靶细胞（SPI_A02_CLG）共培养时，其EGFP表达显著上调。同样，LMP2A_iIL-12_TRUCKs和LMP2A_iIL-18_TRUCKs在识别靶细胞后，培养上清中IL-12或IL-18的浓度也显著增加，且呈效靶比（E:T）依赖性。这证实了所有LMP2A_TRUCK构建体中的NFAT驱动可诱导表达盒能够在CAR激活后成功启动转基因表达。

3.4 LMP2A_CAR-Ts和LMP2A_iIL-18_TRUCKs在识别A02_CLG⁺靶细胞后被特异性激活并释放促炎介质

与A02_CLG⁺靶细胞（T2_CLG, SPI_A02_CLG）共培养时，所有LMP2A靶向T细胞均表现出特异性激活，表现为CD25、CD137和FasL表达显著上调，并释放大量的效应分子，如干扰素γ（IFN-γ）、颗粒酶B（Granzyme B）、穿孔素（Perforin）等。重要的是，LMP2A_CAR-Ts、LMP2A_iEGFP_TRUCKs和LMP2A_iIL-18_TRUCKs的反应是高度特异性的，它们对不携带CLG肽的对照细胞（如T2, T2_SLL, SPI, SPI_A02, SPI_A02_SLL）或HLA-A02:01敲除后加载CLG的细胞（T2^A02ko_CLG）均无显著反应。然而，LMP2A_iIL-12_TRUCKs除了对A02_CLG⁺靶细胞产生强烈反应外，还表现出对仅表达HLA-A02:01（SPI_A02）甚至HLA-A*01:01（SPI_A01）的对照细胞（无论是否加载CLG肽）的脱靶反应，包括激活标记上调和促炎细胞因子（如IFN-γ, IL-12）的释放。

3.5 LMP2A_CAR-Ts和LMP2A_iIL-18_TRUCKs高效特异性清除A02_CLG⁺靶细胞，而LMP2A_iIL-12_TRUCKs也杀伤A01⁺和A02⁺靶细胞

细胞毒性实验结果显示，LMP2A_CAR-Ts、LMP2A_iEGFP_TRUCKs和LMP2A_iIL-18_TRUCKs能高效特异地杀伤A02_CLG⁺靶细胞（T2_CLG, SPI_A02_CLG），而对各种对照靶细胞（包括SPI_A02, SPI_A02_SLL, SPI_A01, SPI_A01_CLG）的活力没有显著影响。LMP2A_iIL-12_TRUCKs虽然对A02_CLG⁺靶细胞展现出最强的杀伤效力，但也介导了对仅表达HLA-A02:01或HLA-A01:01的对照细胞（SPI_A02, SPI_A02_SLL, SPI_A01, SPI_A01_CLG）的明显脱靶杀伤。进一步的机制探究实验表明，这种脱靶反应并非由LMP2A特异性scFv引起，而是与IL-12的作用相关。在T细胞制备过程中，外源性添加IL-12对对照CAR-T细胞（Delta_CAR-Ts）或LMP2A_CAR-Ts进行预刺激，能够诱导出与LMP2A_iIL-12_TRUCKs相似的表型改变（T_EM为主，出现CD56⁺CD94⁺CD62L⁺ NK样细胞亚群）和脱靶反应（对表达HLA-I类分子的细胞产生非特异性激活和杀伤），提示LMP2A_iIL-12_TRUCKs在制备过程中因IL-12的泄漏表达而发生了功能重编程，降低了其激活阈值，导致了对HLA分子的非特异性反应。

3.6 实时分析表明LMP2A_iIL-18_TRUCKs比LMP2A_CAR-Ts更快速地清除A02_CLG⁺靶细胞

使用xCELLigence实时细胞分析系统进行的动力学分析进一步证实了上述发现。所有LMP2A靶向T细胞均能有效抑制SPI_A02_CLG靶细胞的生长。其中，LMP2A_iIL-12_TRUCKs和LMP2A_iIL-18_TRUCKs在共培养开始后数小时内即表现出迅速且持续的杀伤作用。而LMP2A_CAR-Ts和LMP2A_iEGFP_TRUCKs在初始杀伤后，靶细胞出现部分再生长的趋势。定量分析（曲线下面积AUC）表明，所有LMP2A靶向T细胞介导的细胞毒性均显著高于未转导T细胞对照组，且LMP2A_iIL-18_TRUCKs的杀伤动力学优于基础LMP2A_CAR-Ts。

4 讨论/结论

本研究成功开发了靶向EBV LMP2A衍生A02_CLG表位的TCR-like CAR-T细胞及其可诱导表达细胞因子的TRUCK变体。研究结果表明，基础的LMP2A_CAR-Ts和可诱导表达IL-18的LMP2A_iIL-18_TRUCKs对表达A02_CLG复合物的靶细胞具有高度特异性，能有效介导T细胞激活、释放多种效应细胞因子和细胞毒性分子，并高效杀伤靶细胞，且未观察到对无关HLA-肽复合物的脱靶反应。LMP2A_iIL-18_TRUCKs相较于基础CAR-Ts，在某些功能指标（如更快速的杀伤动力学、部分细胞因子释放增加）上显示出潜在优势，并且其诱导表达的IL-18有望在体内重塑肿瘤微环境，招募和激活自然杀伤（NK）细胞等先天免疫细胞，从而可能产生更强的抗肿瘤免疫和对抗EBV免疫逃逸机制的能力。

然而，可诱导表达IL-12的LMP2A_iIL-12_TRUCKs虽然在体外对A02_CLG⁺靶细胞表现出强大的效应功能，但在制备过程中由于IL-12的泄漏表达，导致了T细胞表型向终末效应记忆状态偏移、衰竭标记表达升高，并引发了针对表达HLA-I类分子（如HLA-A02:01, HLA-A01:01）的对照细胞的脱靶反应，这限制了其临床应用的安全性。进一步的实验证实，这种脱靶反应是由IL-12信号而非CAR scFv本身引起的。

综上所述，LMP2A_CAR-Ts，特别是LMP2A_iIL-18_TRUCKs，作为一种“现货型”的细胞治疗产品，展现出了治疗EBV相关恶性肿瘤（如PTLD、HL等）的巨大潜力，尤其适用于缺乏合适供体或标准EBV特异性T细胞治疗失败的患者。它们提供了针对病毒特异性靶点的精准杀伤，并有可能通过局部释放IL-18来克服肿瘤免疫抑制微环境。未来的研究需要进一步在体内模型（包括人源化小鼠模型）中验证其安全性和有效性，并探索其在实际临床场景中的应用前景。