衰老成纤维细胞通过旁分泌机制调控上皮细胞辐射反应的新机制

《Cell Death Discovery》：Senescent fibroblasts modulate the radiation response of neighboring epithelial cells

本研究针对辐射诱导肺损伤(RILI)中细胞衰老的调控机制，团队通过建立肺上皮-成纤维细胞直接共培养3D球体模型，发现辐射后衰老的成纤维细胞可通过旁分泌作用显著促进共培养上皮细胞的衰老进程。单细胞测序鉴定出12个辐射应答核心基因（包括SERPINB2/4/7、TFPI2等），为RILI的早期干预提供了新型生物标志物和潜在治疗靶点。

　　

当肺癌或胸腺瘤患者接受胸部放疗时，辐射诱导肺损伤（RILI）往往成为限制治疗剂量的关键因素。这种损伤可表现为急性放射性肺炎和晚期肺纤维化，严重影响患者生活质量。传统观点认为上皮细胞是辐射后主要衰老细胞类型，但不同肺细胞类型在放疗过程中的动态相互作用机制始终是未解之谜。

在《Cell Death Discovery》最新发表的研究中，德国杜伊斯堡-埃森大学研究团队通过创新性的三维球体共培养模型，首次揭示了成纤维细胞辐射衰老对上皮细胞的调控作用。研究发现传统2D培养条件下所有细胞类型均主要呈现衰老表型，而在更接近生理状态的3D共培养体系中，衰老成纤维细胞可通过旁分泌机制主动诱导相邻上皮细胞衰老，这一发现为理解RILI发病机制提供了全新视角。

研究团队运用多种关键技术方法：通过Transwell间接共培养系统分析细胞间通讯；建立基底膜游离的肺上皮-成纤维细胞3D球体模型模拟体内微环境；采用流式细胞术检测衰老标志物（C12FDG染色）和细胞周期分布；结合单细胞RNA测序（28,587个细胞）解析辐射后不同细胞亚群的转录组变化；利用基因集富集分析（GSEA）验证衰老相关基因特征。

辐射诱导的成纤维细胞衰老特征

在2D培养体系中，10Gy照射96小时后，WI-38成纤维细胞衰老比例从5.31%激增至56.46%，显著高于上皮细胞（37.12%）。值得注意的是，成纤维细胞衰老不依赖经典的p21-p53轴，而伴随CAV1（caveolin-1）蛋白水平下降和p38 MAPK通路激活。

p≤0.05,p≤0.005,p≤0.001.B Morphological alterations in response to RT treatment were visualized following crystal violet staining. Representative photographs from control(0 Gy) and RT(10 Gy)-treated cells are exemplarily shown. Magnification: 5x.C Viabilities of indicated cells were analyzed with or without radiation treatment(10 Gy) after 96 h using the WST-1 reagent. Estimated values were related to respective control treatment(0 Gy; set as 1). Data represent mean values±SEM from 4 to 5 independent experiments measured in quadruplets each.D Cell cycle phases were analyzed by flow cytometry. Graphs consist of data from 4 to 5 individual experiments(with SEM).E Apoptotic(subG1) cell fractions were additionally depicted.P by unpaired(two-tailed)test depicted as#p≤0.05.F Clonogenic survival of respective cells was evaluated following RT with indicated doses(0-6 Gy) at 10 days post treatment. Data show the surviving fractions(left) and the plating efficiencies(PE at 0Gy, right) from 3 to 4 independent experiments measured in triplicates each(means±SD). P by unpaired(two-tailed) t-test depicted as#p≤0.05,##p≤0.01,####p≤0.001(compared to HBEC) and by one-way ANOVA, followed by post hoc Tukey's multiple comparisons test:p≤0.001.'>

共培养体系中细胞间相互作用

Transwell共培养实验显示，成纤维细胞与上皮细胞共培养时，后者的基础衰老水平显著升高（HS-5共培养组0Gy时衰老比例达17.84%）。在3D球体直接共培养模型中，单纯上皮细胞球体辐射后未出现明显衰老，而与成纤维细胞共培养后，上皮细胞衰老比例从4.96%升至13.64%，证实成纤维细胞对上皮细胞衰老的促进作用。

3D球体模型的辐射反应特征

球体生长分析显示成纤维细胞单独培养时球体体积最大，辐射后体积显著减小（10Gy照射96小时后从20.31μm3降至13.83μm3）。流式细胞术检测发现共培养球体中成纤维细胞凋亡比例显著高于上皮细胞（19.27% vs 11.74%），表明成纤维细胞对辐射更为敏感。

p≤0.05,p≤0.01,*p≤0.001 and additionally by unpaired(two-tailed) t tests depicted as#p≤0.05,##p≤0.01 and###p≤0.005(A,F,G).'>

单细胞测序解析细胞亚群响应

通过单细胞RNA测序鉴定出10个主要细胞亚群，包括基底细胞、纤毛细胞、分泌细胞、肺泡祖细胞和成纤维细胞等。辐射后肺泡相关细胞簇（KLF5+APC、肺泡#1/#2）比例增加，提示再生反应；而气道细胞簇（纤毛细胞、分泌细胞）和成纤维细胞簇呈现明显衰老特征。

辐射响应基因特征鉴定

基因集富集分析显示"SenMayo"衰老基因特征在多个细胞簇中显著富集。研究人员鉴定出12个辐射诱导的核心基因（SERPINB2、SERPINB4、SERPINB7、TFPI2、MMP1、MMP3等），这些基因在肺泡、气道和成纤维细胞meta簇中共同上调，构成了肺特异性辐射衰老特征。

本研究系统阐明了辐射诱导肺损伤中细胞衰老的动态调控网络。创新性地发现成纤维细胞作为辐射敏感细胞，通过旁分泌机制主动调控上皮细胞衰老进程。3D球体模型成功模拟了体内肺组织复杂性，单细胞测序技术则从分子层面揭示了不同细胞亚群对辐射的差异化响应。特别值得关注的是，CAV1蛋白在成纤维细胞辐射衰老过程中的下调现象，以及p38 MAPK通路的激活特征，为理解衰老机制提供了新线索。

鉴定出的12基因辐射响应特征（特别是SERPIN家族成员和TFPI2）具有重要转化医学价值。这些基因不仅可作为RILI早期诊断的生物标志物，还有望成为senolytic（衰老细胞清除）药物的新靶点。研究结果强调，针对成纤维细胞-上皮细胞相互作用环节的干预策略，可能为临床预防和治疗辐射诱导肺损伤提供新途径。

该研究建立的实验体系和方法学创新为肺损伤研究提供了重要平台，未来可进一步拓展至其他器官辐射损伤研究领域。通过精准解析细胞间通讯网络，有望开发出针对特定细胞类型衰老的靶向治疗策略，最终改善肿瘤患者放疗后的生活质量。