UVA诱导衰老成纤维细胞通过IL-6/GDF-15表观遗传调控促进黑色素瘤生存的新机制

《Cell Death Discovery》：The dark side of the light (UVA): melanoma microenvironment and cell survival strategies

本研究针对UVA辐射如何通过衰老微环境促进黑色素瘤进展的科学问题，首次揭示了衰老成纤维细胞通过旁分泌IL-6诱导GDF-15基因启动子低甲基化，进而激活p53转录因子介导的促生存通路。研究人员发现UVA照射的衰老成纤维细胞条件培养基能显著降低黑色素瘤细胞凋亡，并通过IL-6/STAT3/p53信号轴调控GDF-15表达。该研究为理解黑色素瘤在基因毒性应激下的生存策略提供了新视角，对开发联合靶向GDF-15和IL-6的 melanoma治疗策略具有重要启示意义。

　　

在发达国家，皮肤黑色素瘤的发病率正以前所未有的速度增长，尤其在老年人群中这一趋势更为明显。多年来，科学研究已经确认阳光中的紫外线（UV）是导致皮肤癌的主要环境因素，但其中长波紫外线（UVA）在黑色素瘤发生发展中的具体作用机制仍有许多未解之谜。特别令人困惑的是，为什么有些黑色素瘤细胞在遭受UVA引起的DNA损伤后选择死亡，而另一些却能顽强存活甚至加速进展？

传统观点认为，当细胞DNA受损时，p53蛋白会扮演"基因组守护者"的角色，要么启动修复程序，要么在损伤过于严重时诱导细胞凋亡。然而在黑色素瘤中，这一经典通路似乎出现了异常：p53不仅失去了抑癌功能，反而可能参与激活促生存信号。更复杂的是，随着年龄增长，皮肤中的成纤维细胞逐渐进入衰老状态，它们会分泌一系列炎性因子（即衰老相关分泌表型，SASP），为周围的肿瘤细胞创造特殊的微环境。这种衰老微环境如何与UVA辐射相互作用，共同影响黑色素瘤的命运决定，成为领域内亟待解决的关键科学问题。

针对这一科学空白，来自德国乌尔姆大学的研究团队在《Cell Death Discovery》上发表了他们的最新发现。他们首次揭示了一个令人惊讶的机制：UVA照射的衰老成纤维细胞能够通过分泌白细胞介素-6（IL-6），改变邻近黑色素瘤细胞的表观遗传状态，从而激活一种名为生长分化因子15（GDF-15）的促生存蛋白的表达，帮助肿瘤细胞在基因毒性应激条件下逃避免疫清除。

研究团队采用了一系列先进的技术方法，包括Transwell迁移实验、抗体芯片和ELISA技术、Annexin V凋亡检测、异种移植瘤模型、蛋白质印迹分析、EpiTect甲基化PCR阵列、甲基化敏感性限制性内切酶PCR（MELP）技术、荧光素酶报告基因检测、p53/MDM2复合物分析、电泳迁移率变动分析（EMSA）以及集落形成单位（CFU）实验等。这些技术的综合运用使得团队能够从细胞迁移、凋亡、表观遗传调控、信号通路激活等多个维度全面解析UVA辐射下黑色素瘤细胞的生存策略。

UVA照射的衰老成纤维细胞条件培养基增强黑色素瘤细胞系迁移能力

研究人员发现，经过UVA照射的A375黑色素瘤细胞向照射后的衰老和年轻成纤维细胞条件培养基（CM）的迁移能力显著增强。Transwell迁移实验显示，与未照射的对照组相比，照射组的细胞迁移数量明显增加，胶原蛋白作为阳性对照，而0.2% DMEM无FCS作为阴性对照。这一结果表明，UVA处理的成纤维细胞分泌的因子能够促进黑色素瘤细胞的侵袭性行为。

UVA照射的衰老成纤维细胞条件培养基中IL-6增强而GDF-15减少

通过细胞因子和趋化因子分析，研究人员发现30 J/cm2 UVA照射的衰老成纤维细胞条件培养基中IL-6显著上调，而GDF-15水平降低。热图和柱状图清晰展示了这一发现，IL-6在照射组中的变化倍数达到3.5倍，而未照射组仅为1.1倍。通过抗体特异性ELISA进一步证实了这一结果，表明UVA照射的成纤维细胞在改变其分泌组方面具有特异性。

UVA照射的黑色素瘤细胞条件培养基显示IL-6和IL-6R剂量依赖性减少

有趣的是，与成纤维细胞相反，A375黑色素瘤细胞在UVA照射后以剂量依赖的方式减少IL-6分泌。ELISA、免疫荧光和蛋白质印迹结果一致表明，照射后IL-6和其受体IL-6R（GP130）表达均下降，这一现象可通过添加200 pg/mL重组IL-6部分恢复。使用甲基化调节剂MMS和去甲基化剂AZA的处理表明，这种调节并非通过全基因组甲基化变化介导。

UVA照射的衰老成纤维细胞条件培养基挽救UVA照射的黑色素瘤细胞免于凋亡

研究发现，用30 J/cm2 UVA照射的衰老成纤维细胞条件培养基处理同样剂量的A375黑色素瘤细胞，可显著减少细胞凋亡（通过Annexin V染色检测）。相反，在相同处理下，黑素细胞却显示出更高的凋亡率。具体而言，衰老成纤维细胞的条件培养基使黑色素瘤细胞凋亡持续减少超过10.69%，而使黑素细胞凋亡增加15.3%。当用200 pg/mL的IL-6代替条件培养基时，也观察到类似的抗凋亡效果。

过表达IL-6的年轻成纤维细胞的旁分泌分泌在异种移植中增加黑色素瘤体积

为了研究成纤维细胞分泌的IL-6对UVA照射黑色素瘤细胞的功能影响，研究人员将黑色素瘤细胞与过表达IL-6的年轻成纤维细胞共同注射到SCID小鼠体内。定量结果显示，与单独注射黑色素瘤细胞或与衰老成纤维细胞共同注射相比，IL-6过表达的年轻成纤维细胞组肿瘤体积显著更大，表明IL-6在体内环境下能促进黑色素瘤生长。

IL-6的多效性作用诱导黑色素瘤细胞增殖、DNA损伤修复和基因毒性应激下的抗凋亡保护

研究人员深入探索了IL-6介导的保护机制。UVA照射后，pATM/ATM比率上调，但IL-6补充降低了这一比率。同时，IL-6处理增加了磷酸化mTOR和磷酸化RB，降低了磷酸化PTEN，表明细胞向增殖和蛋白质合成方向转变。促凋亡基因caspase 3和BAX在UVA和IL-6处理后下调，而抗凋亡基因GDF-15上调，提示IL-6通过ATM-mTOR-GDF-15轴促进细胞生存。

UVA照射的衰老成纤维细胞条件培养基改变UVA照射黑色素瘤细胞中GDF-15基因启动子的甲基化状态

通过EpiTect甲基化PCR阵列分析，研究人员发现与UVA照射的衰老成纤维细胞条件培养基共培养的黑色素瘤细胞表现出GDF-15启动子区域的低甲基化。特别是在原代黑色素瘤细胞系WM-115中，年轻照射成纤维细胞条件培养基导致9%的低甲基化，而衰老照射成纤维细胞条件培养基导致20%的低甲基化。转移性细胞系WM-266-4则显示90%的GDF-15低甲基化，而黑素细胞对照组显示86%的高甲基化。

升高的IL-6浓度导致黑色素瘤细胞系中GDF-15孤儿CpG启动子的选择性低甲基化

研究发现，UVA照射和重组IL-6引起黑色素瘤细胞全基因组DNA高甲基化，但GDF-15启动子的CpG岛却出现特异性低甲基化。使用甲基化敏感性限制性内切酶分析显示，UVA照射显著增加A375黑色素瘤细胞的高甲基化水平，而IL-6处理则剂量依赖性地增加GDF-15启动子的低甲基化。这种低甲基化与GDF-15分泌增加相关，且可被去甲基化剂AZA增强，而被甲基化剂MMS抑制。

黑色素瘤活检组织中GDF-15孤儿CpG启动子低甲基化且其表达升高

对黑色素瘤患者组织切片的免疫组化分析显示，与健康老年皮肤相比，黑色素瘤活检组织中GDF-15表达更高，且5-甲基胞嘧啶（5MC）表达较低，表明低甲基化状态。同时，黑色素瘤真皮区显示高IL-6表达，但与高甲基化水平无关。GDF-15表达更常见于Melan A阳性的转移性黑色素瘤细胞中。

白细胞介素-6调控黑色素瘤细胞中GDF-15基因启动子活性

通过荧光素酶报告基因实验，研究人员证实增加IL-6浓度可增强UVA暴露的A375黑色素瘤细胞中GDF-15启动子活性，而添加IL-6中和抗体则降低此活性。重要的是，全基因组去甲基化剂AZA和甲基化剂MMS不能像重组IL-6那样有效恢复或抑制启动子活性，表明IL-6特异性地促进GDF-15启动子CpG岛的去甲基化。

白细胞介素-6使p53在Ser392位点磷酸化，后者结合GDF-15启动子的CpG p53位点并在A375黑色素瘤细胞中激活它

研究发现，30 J/cm2 UVA照射下调p53在ser392位的磷酸化，而重组IL-6补充则上调此磷酸化。在GDF-15过表达的A375黑色素瘤细胞中，磷酸化p53 ser392水平升高，而GDF-15敲低细胞中此水平降低。电泳迁移率变动分析（EMSA）证实，p53能够结合并激活低甲基化的GDF-15启动子。

IL-6通过WT p53^Ser392/突变p53^N239Y、TET1/APOBEC激活及随后的磷酸化STAT3激活差异性地增强GDF-15转录

研究发现，UVA暴露和重组IL-6补充上调了磷酸化STAT2、STAT3和STAT5。特别是pSTAT3能够激活野生型和突变型p53，表明突变p53也可被STAT3磷酸化。同时，IL-6补充还上调了DNA损伤修复蛋白复合物（BRCA1、Mre11、Rad50、NBS1、XLF），增强了细胞的DNA修复能力。

研究结论与讨论部分强调了这一发现的重要意义。该研究首次阐明了UVA照射下衰老微环境通过IL-6/GDF-15/p53轴促进黑色素瘤生存的表观遗传机制。特别值得注意的是，研究发现IL-6能够诱导GDF-15启动子的特异性低甲基化，同时通过STAT3轴激活p53^Ser392或p53^N239Y，最终增强黑色素瘤细胞在UVA辐射基因毒性应激下的生存能力。

这一发现不仅深化了我们对黑色素瘤耐药机制的理解，更重要的是为临床治疗提供了新的靶点思路。研究人员提出，联合使用GDF-15抑制剂Ponsegromab（已进入II期临床试验）和IL-6抑制剂Tocilizumab，可能通过促进癌细胞凋亡来改善黑色素瘤患者的预后。尽管黑色素瘤患者确诊后不会刻意暴露于UVA，但控制p53突变细胞的转录活性，结合化疗治疗，可能为减少黑色素瘤复发提供新的治疗策略。

该研究的创新性在于将衰老微环境、UVA辐射应激反应和表观遗传调控有机联系起来，揭示了肿瘤细胞在不利环境中生存的复杂调控网络。未来研究可进一步探索这一通路在其他类型癌症中的普适性，以及针对这一通路的新型治疗策略的开发。