基于CRISPRoff/CRISPRon表观遗传编程的原代人T细胞疗法：实现高效、持久及多重基因调控的新平台

《Nature Biotechnology》：Integrated epigenetic and genetic programming of primary human T cells

本文推荐了一种基于全RNA平台的CRISPR表观遗传编辑系统（CRISPRoff/CRISPRon），可在原代人T细胞中实现高效、持久且可多重编程的基因沉默（CRISPRoff）与激活（CRISPRon）。该系统通过瞬时递送mRNA，避免了双链断裂（DSB）相关风险及Cas蛋白的持续表达，显著提升了工程化T细胞（如CAR-T）的治疗安全性及抗肿瘤功能，为下一代细胞疗法提供了强大工具。

　　

Durable and specific silencing of endogenous genes in primary human T cells

研究团队首先优化了CRISPRoff mRNA的设计，通过比较不同帽结构（如Cap1、ARCA、m⁷G）、碱基修饰（1-Me ps-UTP）及密码子优化策略，筛选出最高效的CRISPRoff 7 mRNA（含Cap1帽及1-Me ps-UTP修饰）。该mRNA在原代人T细胞中针对含CpG岛（CGI）的基因（如CD151、CD55、CD81）实现了持久沉默，其效果在28天内（经历约30–80次细胞分裂及多次抗CD2/CD3/CD28抗体再刺激）仍保持稳定，沉默效率达93%以上，与Cas9敲除（KO）效果相当。RNA测序（RNA-seq）及全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）证实CRISPRoff具有高度特异性，仅靶基因表达显著下调，且靶点启动子区DNA甲基化水平显著升高。此外，CRISPRoff在治疗相关基因（如FAS、PTPN2、RC3H1、SUV39H1）中也表现出高效沉默能力，且脱靶效应极低。

CRISPRoff silencing at genes that lack CGI annotations

团队进一步探索了CRISPRoff在非CpG岛基因中的沉默效果。针对CD5、LAG3、PDCD1（PD-1）、ENTPD1（CD39）等基因，CRISPRoff介导的沉默稳定性因基因启动子区CpG二核苷酸数量而异：CD5和LAG3沉默效果持久（30天后沉默效率达99%），而CD45则无法维持稳定沉默。研究表明，启动子区域CpG密度与沉默持久性正相关，但部分低CpG密度基因仍可被有效调控，为拓展表观遗传编辑应用范围提供了依据。

Durable multiplexed gene silencing

多重基因沉默是CRISPRoff的核心优势。研究显示，同时沉默3–5个基因（如CD151、CD81、CD44等）时，CRISPRoff几乎不引起细胞毒性，而Cas9介导的多重敲除则导致显著细胞死亡。CRISPRoff在三重、四重及五重沉默中的效率分别为93.5%、82.4%和65.8%，且沉默效果在长期培养中保持稳定。针对FAS、RC3H1、SUV39H1的三重沉默实验进一步验证了其治疗潜力。

CRISPRon can target an enhancer region in primary human T cells

团队还开发了CRISPRon系统（dCas9-TET1融合蛋白），用于靶向激活内源基因。以FOXP3基因的Treg特异性去甲基化区域（TSDR）为靶点，CRISPRon在常规CD4⁺ T细胞（Tconvs）中成功诱导FOXP3稳定表达（持续28天），并通过靶向亚硫酸氢盐测序证实TSDR区域甲基化水平降低。该成果首次实现了通过增强子表观编辑在原代细胞中长效调控关键基因。

CAR-T cell enhancement with genetic and epigenetic engineering

最后，研究将表观遗传编辑与基因编辑结合，用于增强CAR-T细胞功能。通过正交CRISPR系统（Cas12a介导TRAC位点CAR敲入 + CRISPRoff介导RASA2沉默），避免了sgRNA互换导致的易位风险。体外重复刺激实验表明，RASA2沉默的CAR-T细胞具有更强持续杀伤能力；体内实验中，RASA2沉默的CD19-CAR-T细胞显著抑制白血病模型肿瘤生长并延长小鼠生存期。此外，非病毒递送体系（如截短sgRNA）也展现出临床转化潜力。

Discussion

本研究建立了全RNA递送的CRISPR表观遗传编辑平台，克服了传统基因编辑的基因毒性、免疫原性及多重编辑难题。CRISPRoff/CRISPRon系统在原代T细胞中实现持久、特异及多重基因调控，为下一代细胞疗法的精准设计开辟了新路径。