酸性食品中高静水压力灭活芽孢的机制研究及其在草莓饮料中的应用

《LWT》：High-pressure inactivation of strawberry beverage-derived Bacillus spores in acidic environment: Impact of antimicrobial agents, temperature, pressure level and internal structure

本研究针对酸性食品中耐压芽孢难以彻底灭活的技术难题，探讨了高静水压力（HHP）结合中温或抗菌剂对草莓饮料中优势芽孢的灭活效果及机制。研究发现500 MPa HHP结合50°C处理可通过破坏芽孢皮层和内膜结构，显著灭活Bacillus licheniformis、B. subtilis和B. cereus芽孢，且酸性环境会抑制芽孢萌发途径。该研究为酸性饮料的非热杀菌提供了新策略，对保障食品微生物安全具有重要意义。

　　

在追求健康饮食的今天，消费者对果汁、蔬菜汁等酸性饮料的需求日益增长。然而，这类产品却面临着一个隐形威胁——细菌芽孢。芽孢是某些细菌（如芽孢杆菌）在恶劣环境下形成的休眠体，它们像"太空舱"一样，能抵抗高温、酸性和辐射等极端条件。传统巴氏杀菌可以杀死普通细菌，但对芽孢往往无能为力。更棘手的是，酸性环境虽然能抑制大多数微生物生长，却无法有效杀灭芽孢。这些"顽固分子"可能在产品储存期间复苏、生长，导致腐败甚至食品安全问题。

高静水压力（HHP）技术作为一种非热加工方法，能较好保持食品的感官和营养品质，已被应用于多种食品的杀菌。然而，HHP对酸性食品中芽孢的灭活效果及机制尚不明确。为此，研究人员在《LWT》上发表论文，系统研究了HHP对酸性食品中芽孢的灭活效果及其作用机制。

研究团队首先从市售草莓饮料中分离鉴定出主要的耐压芽孢菌株，发现Bacillus licheniformis、B. subtilis和B. cereus的芽孢在酸性条件（pH 3.43）下表现出较强的压力抗性。随后，他们评估了HHP结合不同处理方式（抗菌剂、中温）对这些芽孢的灭活效果，并通过多种技术手段分析了芽孢结构变化和二吡啶甲酸（DPA）释放情况。

关键技术方法包括：16S rDNA测序鉴定优势菌株；相衬显微镜、扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）观察芽孢形态结构变化；流式细胞术结合SYTO 16/PI双染色分析芽孢内膜损伤和萌发状态；荧光光谱法检测DPA释放；以草莓饮料为实际食品基质验证处理效果。

3.1. 草莓饮料中高耐压芽孢的筛选

研究人员发现，草莓饮料经80°C/20分钟热处理和550 MPa/25°C HHP处理后，好氧菌数下降均不足0.5个对数值，证实饮料中存在大量芽孢。通过16S rDNA测序，鉴定出B. altitudinis、B. licheniformis、B. subtilis、B. cereus、B. tequilensis和B. toyonensis六种芽孢杆菌。进一步在pH 3.43的酸性条件下评估它们的耐压性，结果显示B. licheniformis、B. subtilis和B. cereus的芽孢存活率最高，被确定为高耐压芽孢。

3.2. HHP联合抗菌剂在酸性条件下对高耐压芽孢的灭活效果

将HHP（500 MPa/25°C）与尼辛（nisin）或二碳酸二甲酯（DMDC）联用，发现仅对B. subtilis芽孢有协同灭活作用（分别增加约0.8和0.7个对数值灭活），对B. licheniformis和B. cereus芽孢效果不显著。这表明抗菌剂与HHP联用的效果具有菌株特异性。

3.3. HHP处理温度对酸性环境下芽孢灭活、DPA释放及结构的影响

将HHP（500 MPa）的处理温度从25°C提升至37°C和50°C，发现对三种高耐压芽孢的灭活效果均增强，尤其对B. subtilis芽孢在50°C时灭活效果显著（超过4个对数值）。实际草莓饮料经500 MPa/50°C处理后，好氧菌数降低超过1个对数值，且产品品质指标无显著变化。通过显微镜观察、流式细胞术和DPA检测发现，随着温度升高，芽孢内膜（IM）损伤加剧（PI阳性率从18.6%升至71.3%），DPA释放增加（从88.2%至91.2%），但皮层和SASPs（小酸溶性芽孢蛋白）降解有限（SYTO 16阳性率仅从1.3%升至7.1%）。电镜结果进一步显示芽孢外层结构收缩、多层结构紊乱、内膜损伤。表明在酸性条件下，HHP联合中温主要通过直接物理破坏芽孢结构导致灭活，而非诱导萌发途径。

3.4. HHP处理压力水平对酸性环境下芽孢灭活、DPA释放及结构的影响

在25°C下，考察100-500 MPa压力对B. subtilis芽孢的灭活效果。结果显示，仅当压力达到400-500 MPa时才出现显著灭活（500 MPa时约1.5个对数值）和大量DPA释放（500 MPa时96.2%）。流式细胞术表明，所有压力下SYTO 16阳性率均很低（3-5%），再次证实皮层/SASPs降解受限；而PI阳性率在400-500 MPa时显著升高（约14.2%），表明该压力范围足以损伤内膜。

3.5. 芽孢内在结构对酸性环境下HHP处理灭活效果的影响

利用突变株研究发现，孢子衣壳缺陷株（ΔcotE）对HHP的敏感性显著高于野生株，而SASPs缺陷株（ΔsspA ΔsspB）和DNA修复酶缺陷株（ΔrecA）与野生株无显著差异。此外，在较低温度（23°C）下形成的芽孢对HHP更敏感。这表明芽孢的外层结构（如孢子衣壳）和膜特性是影响其HHP抗性的关键因素。

研究结论表明，HHP（特别是500 MPa）结合中等温度（如50°C）能有效灭活酸性饮料中的耐压芽孢。其机制主要是在酸性环境抑制萌发的前提下，通过高压和温度的协同作用，直接、不可逆地破坏芽孢的孢子衣壳、皮层和内膜结构，导致DPA泄漏和核心复水，最终实现灭活。孢子衣壳的完整性和形成温度影响芽孢的HHP抗性。该研究阐明了HHP在酸性条件下灭活芽孢的特殊机制（以结构损伤为主），为开发针对酸性食品的高效非热杀菌工艺提供了重要的理论依据和实践指导，对提升此类产品的微生物安全性和延长货架期具有重要意义。