非血红素铁酶催化氮杂环丁烷氨基酸生物合成机制的揭示

《Nature Chemistry》：Azetidine amino acid biosynthesis by non-haem iron-dependent enzymes

本研究针对氮杂环丁烷环生物合成机制不明的科学问题，报道了多氧霉素中polyoximic acid(PA)的生物合成机制。研究人员通过遗传学、酶学和结构生物学实验发现，PolF是血红素加氧酶样双金属氧化酶(HDO)超家族成员，能够单独催化L-异亮氨酸(L-Ile)和L-缬氨酸通过3,4-脱饱和中间体转化为氮杂环丁烷衍生物。研究证实μ-过氧-Fe(III)2中间体直接负责未活化C-H键裂解，而C-N键形成可能通过自由基机制进行。同时发现PolE是Fe/蝶呤依赖性氧化酶，通过特异性催化L-Ile脱饱和辅助PolF功能。该研究为氮杂环丁烷生物合成和HDO酶催化机制提供了重要见解。

　　

氮杂环丁烷作为四元氮杂环结构，因其高环张力(25.4 kcal mol^-1)而成为药物研发中的重要骨架，广泛存在于多种生物活性化合物中。然而，这种特殊结构的生物合成机制长期以来困扰着科学家。传统的生物合成途径往往需要依赖昂贵的代谢前体，如S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)依赖的酶催化机制或α-酮戊二酸(α-KG)/Fe依赖的加氧酶机制，这限制了其在生物催化中的应用。多氧霉素A中的polyoximic acid(PA)作为一种氮杂环丁烷氨基酸，其生物合成机制更是迷雾重重。

在《Nature Chemistry》最新发表的研究中，杜亚南等人通过系统的实验设计，揭开了这一谜团。研究人员发现，在多氧霉素生物合成基因簇中，PolF能够独立完成从L-Ile到PA的转化，而此前被认为可能参与该过程的PolC实际上并不参与PA生物合成。这一发现挑战了传统认知，为氮杂环丁烷的生物合成提供了全新视角。

研究采用基因敲除、体外功能表征、晶体结构和光谱分析等技术手段。通过体内基因敲除实验发现，polF突变体完全丧失产生多氧霉素A的能力，而polE突变体产量减少约90%，表明PolF是PA生物合成的关键酶。体外酶活实验显示，PolF能够催化L-Ile和L-Val分别转化为PA和3-亚甲基-氮杂环丁烷-2-羧酸(MAA)，且该过程严格依赖Fe(II)和O₂。

PolF是PA生物合成的关键酶

基因敲除实验证实PolF对PA生物合成不可或缺。LC-MS分析显示，polF突变体无法检测到多氧霉素A，而polE突变体产量显著降低，表明PolF在途径中起核心作用。

PolF催化L-Ile向PA的转化

序列和结构同源性分析表明PolF属于HDO超家族。体外重组实验证明，在Fe(II)和O₂存在下，PolF能够直接将L-Ile转化为PA，该过程需要抗坏血酸作为外部还原剂，且对Fe(II)具有高度特异性。

PolF的底物特异性

底物筛选显示PolF对中等大小脂肪族氨基酸具有选择性。除L-Ile外，L-Val也能被转化为MAA，而L-Leu和L-Met主要产生羟基化产物。立体异构体实验表明C2和C3位立体化学对氮杂环丁烷形成重要但不绝对必需。

PolF形成氮杂环丁烷的机制

通过中间体捕获实验，研究人员发现PolF催化三种不同反应：脱饱和、羟基化和C-N键形成。动力学分析表明3,4-脱氢Val(dh-Val)是氮杂环丁烷形成的关键中间体，其转化为MAA的速率(1.2±0.4 min^-1)快于L-Val向dh-Val的转化(0.23±0.04 min^-1)。

PolF催化通过μ-过氧-Fe(III)₂中间体进行

停流光谱实验显示，底物触发的O₂活化产生614 nm特征吸收峰，该特征与μ-过氧-Fe(III)₂物种相关。穆斯堡尔谱进一步证实了该中间体的形成，其参数(δ=0.58 mm s^-1，ΔE_Q=1.26 mm s^-1)与已知的μ-过氧-Fe(III)₂配合物一致。

PolF裂解未活化的C-H键

氘代底物动力学实验揭示了显著的动力学同位素效应(D-KIE)。[3-D]Val实验显示4-OH-Val成为主要产物，而[4,4'-D₆]Val实验则主要产生3,4-dh-Val和Azi，表明PolF通过3-H和4-H攫取启动反应。计算得到的本征D-KIE值(3-H:25，4-H:36)超过半经典极限，提示量子力学隧道效应。

H攫取后反应通过自由基机制进行

KIE分析表明4-H⁺转移的D-KIE为1.3，这一数值太小而不能反映纯质子转移，而与正交质子耦合电子转移(PCET)机制一致，表明脱饱和步骤通过PCET机制进行。

L-Ile配位PolF的双铁簇

X射线晶体结构揭示了Fe₂(II/II)·L-Ile·PolF复合物的精细结构。L-Ile以双齿方式直接配位Fe1，C3和C4原子距离Fe2约4.7-5.2 ?，这一空间排列解释了两个位点都能发生转化的实验现象。与AetD等其他HDO酶不同，PolF缺乏桥连羧酸盐，且配位 sphere 存在显著差异。

PolE催化Ile脱饱和辅助PA生产

功能表征发现PolE是Fe/蝶呤依赖性氧化酶，特异性催化L-Ile的3,4-脱饱和。与PolF相比，PolE的反应具有高度特异性，仅产生3,4-dh-Ile单一产物。耦合实验表明，PolE和PolF共同作用时，PA形成速率提高约3倍，且副产物显著减少。

这项研究的意义不仅在于阐明了氮杂环丁烷氨基酸的生物合成机制，更重要的是拓展了对HDO酶催化功能的认识。研究发现PolF使用相对温和的μ-过氧-Fe(III)₂中间体来实现具有挑战性的C-H键活化，这与通常需要高价铁物种的非血红素铁酶形成鲜明对比。显著的动力学同位素效应和缺乏解耦联的特点使PolF成为研究HDO酶H攫取机制的理想模型。

关于C-N键形成机制，研究提出了两种可能性：氮孤对电子辅助的自由基氧化或烯丙基C4·直接加成到α-NH₂。虽然目前证据尚不能完全区分这两种机制，但晶体结构中α-NH₂与双铁簇的配位模式为后续机制研究提供了重要线索。

此外，PolE的发现揭示了一个庞大的Fe/蝶呤依赖性酶家族(DUF6421)。生物信息学分析显示该家族包含约10,000个同源蛋白，主要存在于放线菌中，具有保守的HE/DXXHX(21-23)E motif，可能负责Fe和BH₄结合。这一发现预示着存在大量未被认识的、产生特殊氨基酸的生物合成途径。

该研究为氮杂环丁烷类化合物的生物制造提供了新的酶催化剂，也为理解HDO酶的超家族功能提供了重要见解。通过阐明这一简洁而高效的生物合成途径，研究人员为未来开发更经济、更高效的氮杂环丁烷合成方法奠定了坚实基础，在药物研发和合成生物学领域具有广阔的应用前景。