选择性光遗传抑制小鼠坐骨神经慢传导纤维的轴突水平研究

《Neuromodulation: Technology at the Neural Interface》：Selective Optogenetic Inhibition of Slow Conducting Fibers at the Level of the Sciatic Nerve Trunk in the Mouse

本研究针对传统外周神经电刺激治疗慢性疼痛存在非选择性激活和脱靶效应的问题，探索了利用光遗传学技术进行选择性抑制的新策略。研究人员通过向小鼠坐骨神经注射AAV6病毒载体，使伤害性感受器特异性表达抑制性光敏感蛋白eNpHR，并在神经干水平应用琥珀光，成功实现了对慢传导电诱发复合动作电位（eCAP）的选择性抑制（约20%降低），为开发精准、直接的慢性疼痛调控方法提供了重要实验依据。

　　

慢性疼痛是一个全球性的重大健康问题，影响着数百万人的生活质量。目前，外周神经刺激（PNS）是一种非药物的慢性疼痛管理方法，它通过激活脊髓中的“闸门”机制来抑制疼痛信号的传递。然而，这种方法存在一个根本性的局限性：电刺激无法轻易地区分感觉纤维和运动纤维，也无法区分不同功能亚型的神经纤维。这导致治疗过程中常常伴随着非目标效应，例如意外的肌肉痉挛或触觉异常。此外，无论是低频刺激引起的异常感觉（感觉异常），还是高频刺激引起的神经去敏感化或传导阻滞，都难以精准地只针对传递疼痛信号的神经纤维（即伤害性感受器，如C纤维和Aδ纤维）发挥作用，从而可能影响正常的触觉和肌肉力量。

面对这一挑战，光遗传学（Optogenetics）技术提供了一种极具潜力的替代方案。这项技术的核心是利用光来控制那些经过基因改造、表达了光敏感蛋白（称为视蛋白，Opsins）的神经元活动。与电刺激的“广谱”激活不同，光遗传学可以通过特定的病毒载体（如腺相关病毒AAV）和细胞特异性启动子，将兴奋性（如Channelrhodopsin-2, ChR2）或抑制性（如enhanced Natronomonashalorhodopsin, eNpHR）视蛋白精准地表达在特定类型的神经元中。这就好比给特定的神经元群体配备了一把只能用特定颜色“光钥匙”开启的“锁”，从而实现了前所未有的细胞类型特异性调控。特别是抑制性视蛋白（如eNpHR，一种氯离子泵），当被特定波长的光（如琥珀光）激活时，可以使神经元超极化，从而抑制其产生或传导动作电位的能力。这种机制为直接、选择性地抑制伤害性感受器的活动，同时不干扰其他正常感觉和运动功能，开辟了新的道路。

尽管先前的研究已经通过行为学实验证明，在皮肤表面应用光来激活表达在坐骨神经伤害性感受器中的eNpHR或其他光门控钾离子通道，可以减轻小鼠的疼痛感知，但这些研究大多关注于神经末梢的抑制，并未深入探究其背后的神经电生理活动变化。此外，经皮给光的方式主要适用于抑制皮肤源性疼痛的起始，对于起源于深层组织（如腿部或背部）或更大皮肤区域的疼痛，以及如何阻断已经产生并正在向中枢神经系统传递的疼痛信号，其效果可能有限。因此，开发一种能够将光直接送达神经干水平的植入式设备，对于实现更广泛、更有效的疼痛抑制至关重要。

为了回答“能否在神经干水平通过光遗传学方法选择性地抑制伤害性感受器的活动”这一核心问题，由Mary G. Ardren、Jerico V. Matarazzo、Elise A. Ajay、Alex C. Thompson、Sophie C. Payne、James B. Fallon和Rachael T. Richardson组成的研究团队，在《Neuromodulation: Technology at the Neural Interface》上发表了一项创新性研究。他们的目标是验证直接对神经干施加光刺激，能否选择性地抑制经过基因改造的伤害性感受器的电活动，并首次通过体内电生理记录的方法来量化这种抑制效果。

为了开展这项研究，研究人员主要运用了几个关键技术方法。他们使用成年C57BL/6小鼠，通过坐骨神经内注射AAV6-hSyn-eNpHR-eYFP病毒载体，将抑制性视蛋白eNpHR靶向递送到伤害性感受器。3-4周后，进行急性在体电生理实验，使用定制的透明硅胶神经袖套电极，在坐骨神经干上施加电刺激以非选择性地诱发包含不同传导速度纤维的复合动作电位（eCAP），同时将琥珀光（595 nm）通过光纤施加到神经干上，以激活eNpHR。通过比较光照前后慢传导eCAP的振幅和阈值变化，来评估光遗传抑制的效果。此外，他们还通过免疫组织化学方法，对腰椎背根神经节（DRG）中eNpHR-eYFP的表达进行了定性和定量分析，使用了NeuN（全神经元标记）、NF200（大直径纤维标记）和CGRP（肽能伤害性感受器标记）等抗体来鉴定表达视蛋白的神经元类型。

选择性视蛋白在小直径神经元中的表达

研究人员首先通过免疫组织化学证实了eNpHR-eYFP在L3-L5背根神经节（DRG）神经元胞体和坐骨神经轴突中的成功表达。定量分析显示，约有7%的NeuN阳性细胞表达了eNpHR-eYFP。表达eNpHR-eYFP的神经元平均胞体面积（236.7 μm²）显著小于总体神经元群体（419.2 μm²），并且75%的eNpHR阳性细胞胞体面积小于等于267 μm²，这与伤害性感受器（主要是C纤维和部分Aδ纤维）的小直径特征相符。进一步分析显示，约24%的eNpHR细胞与肽能伤害性感受器标记物CGRP共标，20%与NF200（通常标记大直径有髓纤维）共标，但后者可能代表了部分Aδ纤维。值得注意的是，约59%的eNpHR阳性细胞既不表达CGRP也不表达NF200，表明视蛋白表达覆盖了异质性的伤害性感受器群体。作为对照，表达兴奋性视蛋白ChR2-mCherry的细胞数量更少（<1%），且平均胞体面积更小（181.9 μm²），进一步支持了AAV6血清型对小型神经元的偏好性。

使用兴奋性视蛋白选择性激活慢传导速度纤维

在表达ChR2-mCherry的小鼠中，研究人员使用蓝光（452 nm）刺激坐骨神经，成功诱发了光诱发复合动作电位（oCAP）。这些oCAP响应是光强度依赖性的，其平均传导速度约为0.3 m/s，属于典型的无髓C纤维范围。蓝光刺激未注射病毒的对照侧神经或使用琥珀光刺激注射侧神经，均未诱发出可检测的反应，证实了光学激活的特异性。这一结果从功能上验证了AAV6-hSyn载体成功地将兴奋性视蛋白靶向递送到了慢传导的伤害性感受器。

使用电刺激非选择性激活纤维

为了评估抑制效果，研究人员首先需要一种能够可靠激活所有类型纤维（包括伤害性感受器）的方法。他们使用电刺激坐骨神经，记录到了多峰的电诱发复合动作电位（eCAP）。根据传导速度，这些响应可以被区分为快速传导（~22 m/s，对应Aβ纤维）、中速传导（~6 m/s，对应Aδ纤维）和慢速传导（~0.6 m/s，对应C纤维）成分，此外还有肌源性活动。激活这些不同纤维类型所需的电荷量呈现出预期的梯度增加（快纤维 < 中纤维 < 慢纤维），这与已知的神经纤维兴奋性规律一致，为后续的光抑制实验奠定了基础。

使用抑制性视蛋白选择性抑制电诱发的慢波纤维

这是本研究最核心的发现。在表达eNpHR-eYFP的小鼠中，当在电刺激的同时施加3-5毫秒的琥珀光脉冲以激活eNpHR时，慢传导eCAP的振幅在电刺激阈值水平出现了显著降低（约20%的减少）。同时，诱发慢传导eCAP所需的电刺激阈值在光照条件下也有所升高。重要的是，这种抑制效应是选择性的，因为琥珀光对快速和中速传导的eCAP振幅以及肌源性活动均没有产生显著影响。抑制效果在距离刺激电极不同距离（3.4 mm和6.8 mm）的记录点均被观察到，且程度相似，表明光刺激是在轴突传导路径上（而非刺激起始点）发挥了抑制作用。研究还发现，抑制效果的程度与组织学测得的视蛋白表达数量之间没有显著相关性，提示抑制效率可能还受其他因素影响，例如光覆盖的神经横截面积比例（光斑直径537 μm小于神经直径）以及电刺激的同步化程度。

本研究通过严谨的实验设计，首次在轴突水平证实了光遗传学技术能够选择性地抑制外周混合神经中伤害性感受器的活动。研究人员成功利用AAV6病毒载体将抑制性视蛋白eNpHR靶向递送到小鼠坐骨神经的小直径伤害性感受器，并通过在体电生理记录，直接观察到施加于神经干的琥珀光能够特异性地抑制慢传导电诱发复合动作电位（eCAP），而对其他类型的神经纤维活动没有影响。这不仅在原理上验证了光遗传抑制的可行性，更重要的是，它将抑制位点从传统的神经末梢（皮肤）提升到了神经干，为干预更深部或更广泛区域的疼痛提供了可能。

讨论部分进一步阐释了本研究的意义和未来方向。首先，研究证实了神经干水平的光遗传抑制能够阻断动作电位的传播，这与经皮给光主要防止动作电位 initiation 的机制有所不同，对于抑制已经产生的疼痛信号可能更具优势。其次，尽管观察到的抑制幅度（约20%）看似有限，但这在短脉冲光刺激下已经证明了概念的正确性；未来通过优化光刺激参数（如延长光照时间）或提高病毒转导效率，有望增强抑制效果。同时，研究人员也指出了本研究的局限性，例如用于诱发eCAP的强电刺激并非生理状态，以及光斑尺寸可能未能覆盖整个神经横截面等。他们建议未来的研究应结合慢性疼痛模型和行为学测试，在清醒动物身上使用长期植入的光学-电学联合调控设备，来评估这种抑制方法对生理性疼痛感知的实际效果。

总之，这项研究为开发一种直接、选择性高且副作用小的慢性疼痛精准治疗方案提供了重要的临床前证据。通过将光遗传学的细胞特异性与神经干干预的广泛适用性相结合，该策略有望克服传统电神经调控的局限性，最终为深受慢性疼痛困扰的患者带来新的希望。尽管将光遗传学应用于临床仍面临病毒递送的安全性、免疫反应以及植入式设备的开发等挑战，但本研究无疑为推动这一前沿领域的发展迈出了坚实的一步。