甘蓝型油菜转录因子靶基因鉴定中CUT&Tag技术的建立与优化及其在调控网络解析中的应用

《New Crops》：Establishment and Optimization of CUT&Tag for Identifying Transcription Factor Target Genes in Rapeseed

为解决传统表观基因组学方法（如ChIP-seq）在非模式作物中依赖稳定转基因株系、周期长、成本高的问题，本研究建立了结合叶肉原生质体分离与CUT&Tag技术的甘蓝型油菜瞬时表达系统。通过优化叶片发育阶段，发现三叶期第二真叶原生质体产量达1.22×107 cells g-1 FW，转化效率63.1%。利用该系统鉴定了转录因子BnaA03.ABI3的调控靶点（如BnaA09.PDS1、BnaC08.AGP2等），并通过双荧光素酶报告基因验证其直接结合与转录激活功能。该技术可在3天内快速、精准解析基因调控网络，为油菜功能基因组学与分子育种提供新工具。

　　

在植物生物学研究中，转录因子如同基因表达的“指挥家”，通过结合特定DNA序列调控下游基因的开启或关闭，从而影响植物的生长、发育及逆境响应。然而，在甘蓝型油菜这类基因组复杂的非模式作物中，解析转录因子的调控网络面临巨大挑战。传统方法如染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）虽能鉴定转录因子结合位点，但严重依赖稳定转基因株系，实验周期长达数月，且成本高昂、通量低。此外，油菜作为异源四倍体作物，基因组大小约为拟南芥的3倍，其调控机制可能存在物种特异性，直接借用拟南芥等模型植物的研究结果往往不够准确。因此，开发一种快速、高效、适用于油菜的转录因子靶基因鉴定技术，成为功能基因组学研究中的迫切需求。

近日发表于《New Crops》的一项研究，成功建立了结合叶肉原生质体瞬时转化与CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）技术的实验体系，为甘蓝型油菜转录因子研究提供了新利器。该技术仅需三天即可完成从原生质体制备到靶基因鉴定的全过程，突破了传统方法的瓶颈。

研究团队首先优化了油菜原生质体的提取方案。通过比较子叶期和三叶期不同叶位的原生质体产量与转化效率，发现三叶期第二真叶为最佳材料，其原生质体产量高达1.22×10⁷ cells g^-1 FW，且直径适中（34.31±7.82 μm）。利用绿色荧光蛋白（GFP）报告基因验证，该来源原生质体的转化效率达63.11%，远高于子叶（9.17%）和第一真叶（31.67%）。进一步测试不同编码序列（CDS）长度的转录因子（如BnaA09.NF-YA7、BnaA03.ABI3等）均能成功表达，表明该系统适用于油菜基因的广泛转化。

在建立高效原生质体转化体系的基础上，研究人员将CUT&Tag技术应用于转录因子靶基因的鉴定。CUT&Tag是一种新型表观遗传学技术，通过抗体引导Tn5转座酶在转录因子结合位点附近切割并连接测序接头，具有背景噪音低、细胞需求量少、实验周期短等优势。本研究以已知靶基因关系的BnaA09.NF-YA7为阳性对照，通过CUT&Tag测序成功鉴定到其下游靶基因BnaA07.ASHH4的启动子结合位点，并发现三个潜在结合 motif（如AGCCCATT等），验证了技术的可靠性。

有效提取油菜叶片原生质体

研究团队以21天苗龄的油菜 cultivar Zhongshuang 11（ZS11）为材料，系统比较了不同叶位原生质体的形态与产量。结果显示，第二、三真叶的原生质体产量显著高于子叶和第一真叶，且细胞大小更均一，为后续转化实验奠定了材料基础。

原生质体转化与转录因子表达

通过聚乙二醇（PEG）介导的转化法，将GFP标记的转录因子载体导入原生质体。荧光显微镜观察证实，第二真叶原生质体不仅转化效率最高，且对不同长度CDS的转录因子均具有良好兼容性，证明其作为瞬时表达平台的普适性。

利用CUT&Tag分析鉴定BnaA09.NF-YA7结合位点

针对BnaA09.NF-YA7的CUT&Tag测序发现，其结合位点显著富集于靶基因启动子区。基因本体（GO）富集分析显示，潜在靶基因主要参与细胞过程、代谢过程及应激响应等生物学通路，与已知功能相符。

通过CUT&Tag鉴定BnaA03.ABI3下游靶基因

研究人员进一步选取种子特异性表达转录因子BnaA03.ABI3进行深入解析。CUT&Tag鉴定出1,057个重叠靶基因，包括已知调控靶点（如BnaA04.ABI5、BnaC02.RAB18）和新靶点BnaA09.PDS1。双荧光素酶报告基因实验证实，BnaA03.ABI3可直接结合BnaA09.PDS1启动子并激活其表达（活性提升3倍以上）。BnaA09.PDS1参与类胡萝卜素合成，可能为ABA合成提供前体，暗示BnaA03.ABI3通过正反馈环路调控种子发育。此外，新靶点BnaC08.AGP2和BnaC02G0144900ZS的发现进一步拓展了该转录因子的调控网络。

CUT&Tag：快速、经济、可靠的油菜转录因子结合位点鉴定工具

研究最终形成标准化操作流程：从三叶期第二真叶提取原生质体，经PEG转化后，利用anti-GFP抗体引导Tn5酶切割靶点DNA，构建测序文库。整个流程可在三天内完成，大幅提升研究效率。

研究结论与讨论部分强调，本研究首次将CUT&Tag技术应用于油菜体系，克服了传统ChIP-seq对稳定转基因材料的依赖。通过优化原生质体制备与转化条件，实现了在绿色叶片组织中高效捕获转录因子结合事件，更真实反映体内调控状态。该技术不仅适用于种子发育相关转录因子（如BnaA03.ABI3），未来还可拓展至逆境响应调控因子研究，为解析油菜复杂调控网络提供通用平台。此外，原生质体系统本身兼容亚细胞定位、蛋白互作等多种分子实验，具有广泛应用潜力。该体系的建立为油菜及其他作物功能基因组学研究提供了新范式，对加速作物分子设计育种具有重要意义。