TDP-43缺失诱导ALS/FTD中隐性多聚腺苷化的新机制及其功能影响

《Nature Neuroscience》：TDP-43 loss induces cryptic polyadenylation in ALS/FTD

本研究针对TDP-43核丢失在肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）中的关键作用，系统揭示了其诱导的隐性多聚腺苷化（cryptic APA）事件。研究人员开发了生物信息学流程PAPA，在iPSC来源的神经元模型中鉴定出三类新型APA（ALE、3'Ext、IPA），并在死后脑组织中验证。研究发现TDP-43通过结合UG富集基序双向调控APA位点选择，其中隐性3'UTR延伸（3'Ext）可通过提高RNA稳定性、促进胞质定位和翻译，导致转录因子ELK1等蛋白水平异常升高。该研究拓展了TDP-43功能丧失的分子后果，为ALS/FTD提供了新的生物标志物和病理机制见解。

　　

在神经退行性疾病研究领域，肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）是两种致命的神经系统疾病，其中超过97%的ALS病例和45%的FTD病例都存在一个共同的病理特征——RNA结合蛋白TDP-43的细胞质聚集和核缺失。这种蛋白在正常情况下主要存在于细胞核内，参与RNA加工的多个环节，包括剪接调控、转运和代谢。

长期以来，科学家们已经知道TDP-43核丢失会导致隐性外显子（cryptic exons）的异常出现，这些隐藏在外显子-内含子边界附近的序列在正常情况下被TDP-43抑制，但在病理条件下会被异常激活，进而可能产生功能异常的蛋白质或导致正常蛋白的减少。然而，在RNA加工的另一重要环节——多聚腺苷化（polyadenylation）方面，TDP-43缺失的影响却鲜为人知。

多聚腺苷化过程负责确定成熟转录本的3'末端，直接影响mRNA的稳定性、定位和翻译效率。在人类蛋白质编码基因中，高达70%的基因存在选择性多聚腺苷化（APA）现象，这使得单个基因能够产生具有不同3'末端的转录本异构体。尽管TDP-43已被证明参与APA调控，但其在神经元背景下对隐性APA事件的系统探索仍属空白。

这项发表在《Nature Neuroscience》上的研究填补了这一空白，揭示了TDP-43核丢失诱导的广泛隐性APA事件，并发现这些事件不仅存在于细胞模型中，也在ALS/FTD患者脑组织中特异表达。更令人惊讶的是，与通常导致蛋白质减少或功能改变的隐性剪接事件不同，某些类型的隐性APA实际上能够增加正常蛋白质的表达水平和功能，这为理解TDP-43蛋白病的分子机制开辟了新视角。

研究人员主要运用了几项关键技术：开发了新型生物信息学流程PAPA，用于从RNA测序（RNA-seq）数据中可靠识别和分类隐性APA事件；利用诱导多能干细胞（iPSC）来源的神经元模型进行TDP-43敲低（knockdown）和条件性敲除（knockout）；采用硫醇（SH）连接的烷基化RNA代谢测序（SLAM-seq）分析RNA稳定性；通过核糖体测序（Ribo-seq）评估翻译水平变化；使用纽约基因组中心（NYGC）ALS联盟的大规模死后脑组织RNA-seq数据集进行验证；以及通过体外报告基因实验和荧光原位杂交（FISH）等技术进行功能验证。

鉴定TDP-43丢失诱导的隐性APA事件

研究团队首先建立了一个包含公开和新生成的批量RNA-seq数据的资源库，这些数据均来自TDP-43缺失的细胞模型。为了全面识别APA事件，他们开发了名为PAPA的计算流程，该流程能够从RNA-seq数据中推断新型最后外显子（last exons），并将其分为三类：替代最后外显子（ALE）、内含子多聚腺苷化（IPA）和3'非翻译区延伸（3'Ext）。

通过这一方法，研究人员在TDP-43敲低的神经元中鉴定出227个隐性APA位点，其中包括92个ALE、86个3'Ext和20个IPA事件。这些事件中，有些如STMN2、ARHGAP32和RSF1是先前已知的隐性外显子，但大多数是新型发现，特别是3'Ext事件。实验验证通过3'RACE和纳米孔直接RNA测序确认了这些预测的隐性多聚腺苷化位点（PAS）的可靠性。

TDP-43结合既抑制又增强多聚腺苷化位点选择

接下来，研究团队利用TDP-43的iCLIP数据分析了其在隐性APA位点附近的结合模式。结果显示，TDP-43结合在隐性ALE的剪接受体附近富集，同时在隐性3'Ext的远端PAS下游也观察到结合信号。为了验证TDP-43结合与隐性PAS使用之间的直接关系，研究人员构建了ELK1 3'Ext的报告基因系统。

实验表明，在正常TDP-43水平下，UG含量的耗竭会增强隐性PAS的使用，而UG二核苷酸含量的增加则会降低其使用。随着TDP-43敲低水平的增加，具有正常、增加或中度破坏UG的构建体中的隐性PAS使用增强，而严重UG耗竭的构建体对TDP-43缺失无反应，证实了TDP-43的直接调控作用。

TDP-43隐性APA在死后ALS/FTD组织中可检测到

研究团队进一步探究了在体外检测到的隐性APA是否也存在于受TDP-43蛋白病影响的死后中枢神经系统（CNS）组织样本中。通过对分选出的神经元核RNA-seq数据进行分析，发现54个隐性APA事件在TDP-43缺失的核中表达更高，包括ALE、3'Ext和IPA所有类型。

利用NYGC ALS联盟的大规模RNA-seq数据集，研究人员特别关注了ALE事件，因为其相关的上游隐性剪接连接为表达提供了直接证据。在118个隐性ALE连接中，有7个满足特异性标准，包括STMN2、SYNJ2和PHF2等，这些事件在预期存在TDP-43蛋白病的组织中最为频繁检测到。

隐性APA事件可变地影响差异表达

与隐性剪接事件通常导致转录水平降低不同，研究人员发现隐性APA对其自身转录本的影响是可变的。在TDP-43敲低的i3Neurons中，大多数隐性APA事件（126个中的86个）与表达的显著变化同时发生，上调和下调的比例均等。不同类别的隐性APA在转录水平变化方面没有明显偏向。

隐性3'Ext事件可导致翻译增加和功能改变

通过Ribo-seq分析，研究团队发现只有少数隐性APA包含基因（126个中的26个）显示整体翻译水平的显著变化。有趣的是，差异翻译的子集似乎按APA类别分层：ALE被下调，而所有四个显著的3'Ext在RNA丰度增加的同时，翻译也显著增加。

基因集富集分析（GSEA）证实，隐性ALE和3'Ext基因分别与翻译减少和增加显著相关。特别值得注意的是，三个3'Ext包含基因ELK1、SIX3和TLX1在RNA和翻译水平上都是最上调的，它们编码三种转录因子。研究人员选择聚焦于ELK1，并通过Western blot验证了在TDP-43敲低的i3Neurons中ELK1蛋白表达显著增加。

隐性3'Ext转录因子具有增加的RNA稳定性

为了探究隐性3'UTR介导翻译水平增加的机制，研究人员通过SLAM-seq分析了RNA稳定性。结果显示，隐性3'Ext包含基因ELK1、TLX1和SIX3的半衰期增加。亚细胞定位分析通过FISH和核质分级实验证实，ELK1隐性3'Ext转录本定位于细胞质和神经突中，并且在TDP-43敲低后显著增加。

此外，通过分级测序（Frac-seq）数据评估，发现ELK1隐性3'Ext在核糖体相关部分相对富集，支持隐性3'Ext优先参与翻译机制。

本研究系统揭示了TDP-43核丢失诱导的隐性APA事件，拓展了对TDP-43病理机制的理解。研究人员开发的PAPA流程为全面研究APA事件提供了有力工具，鉴定出的隐性APA事件不仅为ALS/FTD提供了潜在的生物标志物，也揭示了新的病理机制。

与通常导致蛋白质减少的隐性剪接不同，隐性3'Ext可通过增加RNA稳定性、促进胞质定位和翻译，导致转录因子如ELK1的蛋白水平异常升高，这可能通过改变下游靶基因表达参与疾病发病机制。这一发现表明，隐性RNA加工不仅可以导致蛋白质减少或改变，还可以引起正常蛋白质的过表达和功能增加，为TDP-43功能丧失的分子后果增添了新的维度。

该研究强调了对APA失调在神经退行性疾病中作用的关注的重要性，为未来开发针对TDP-43病理的新治疗策略提供了重要理论基础和实验依据。