乳腺脂肪组织中的多环芳烃及其与乳腺癌和人口统计因素的关联：一项针对伊朗女性的病例对照研究

《Results in Engineering》：Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Breast Adipose Tissue and Their Association with Breast Cancer and Demographic Factors: A Case-Control Study in Iranian Women

本研究通过医院对照设计，首次在伊朗量化了乳腺癌患者与 kontrol组乳腺脂肪组织中17种PAHs的浓度，发现患者PAHs水平显著更高，尤其是高环PAHs。多因素分析表明，就业状态（homemaker风险增加）、教育水平低（PAHs积累相关）、parity（每多生育一胎风险降低52%）及年龄（PAHs积累与年龄正相关，但癌症风险因抽样偏差呈负相关）等社会人口学因素共同影响PAHs暴露和乳腺癌风险。研究强调需结合环境暴露评估与社会科学干预，特别是针对家庭主妇等高危群体。

　　本研究探讨了多环芳烃（PAHs）在伊朗女性乳腺脂肪组织中的浓度及其与乳腺癌风险之间的关系，同时分析了人口统计学因素如何影响PAH暴露水平。研究采用医院为基础的病例对照设计，纳入了98名乳腺癌患者和98名接受美容乳腺手术的非癌症对照组。通过气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）对PAHs进行定量分析，并通过结构化访谈收集人口统计学数据。研究发现，乳腺癌患者体内PAH浓度显著高于对照组，且人口统计学变量如年龄、生育次数、职业和教育水平与PAH浓度存在显著关联。生育次数与较高的PAH暴露水平相关，但与较低的乳腺癌风险有关，这可能是因为妊娠带来的保护机制。家庭主妇则表现出更高的暴露水平和更高的乳腺癌风险，这可能反映了室内污染增加以及对防护行为的接触减少。尽管PAH浓度随年龄增加而上升，但乳腺癌风险却呈现反向关系，这可能与绝经后激素变化有关。这些发现表明，环境暴露与社会决定因素在乳腺癌易感性中具有双重作用。因此，公共健康策略应重点关注室内空气质量、清洁烹饪实践和环境健康教育，特别是针对易受影响的人群。

研究背景显示，乳腺癌是全球女性中最常见的癌症之一，也是癌症相关死亡的主要原因，每年新增病例超过230万例。尽管在早期检测和治疗方面取得了显著进展，乳腺癌的发病率仍在全球范围内持续上升，尤其是在低收入和中等收入国家。乳腺癌的病因是多因素的，包括遗传易感性、激素影响、生育史和生活方式因素。然而，这些已知的风险因素仅能解释部分疾病负担，提示还有其他可能可改变的环境因素参与其中。PAHs因其广泛存在和潜在的内分泌干扰及基因毒性作用而受到关注，尤其是在乳腺癌的研究中。PAHs是有机物质不完全燃烧产生的半挥发性、脂溶性有机化合物，包括化石燃料、生物质和烟草。由于这些物理化学特性，它们容易在富含脂质的组织中积累，例如乳腺组织，其中激素活动可能进一步促进其与激素敏感细胞的相互作用。常见的暴露源包括机动车尾气、工业排放、烧烤或炭烤食品、使用固体燃料的室内烹饪以及香烟烟雾。一旦进入体内，PAHs可以被代谢为具有反应性的中间产物，形成DNA加合物，从而引发与致癌相关的突变过程。

根据欧洲食品安全局（EFSA）的评估，某些PAHs，如苯并[a]芘、苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽和?，被认为具有基因毒性和致癌性。EFSA的风险评估指出，PAHs的暴露，尤其是通过食物和环境污染，可能带来潜在的健康风险，并建议应将暴露控制在合理可行的最低水平（ALARA原则）。由于PAHs的脂溶性，它们更倾向于在脂肪组织中积累，包括乳腺脂肪，其中它们可能长期存在。这一特性使得乳腺脂肪组织成为评估长期环境暴露的关键部位。虽然国际上已有少数研究直接测量了人类乳腺组织或乳腺脂肪样本中的PAHs或PAH- DNA加合物，但这些研究主要集中在非职业暴露女性中，显示出可测量的负担。例如，Rundle等人（2000）发现，乳腺癌患者的乳腺组织中苯并[a]芘-DNA加合物水平显著高于对照组。White等人（2016）发现，来自多种PAH来源的累积暴露，包括烧烤食品、香烟烟雾和车辆排放，与乳腺癌发病率升高有关。Niehoff等人（2017）发现，PAH暴露与绝经后乳腺癌风险有关，并受到体重指数的影响。在土耳其，发现乳腺癌患者的乳腺脂肪组织中苯并[a]芘和茚并[1,2,3-cd]芘浓度升高，支持了这些化合物作为暴露生物标志物的作用。然而，这类研究在中东或低收入和中等收入地区仍十分有限，其中室内和室外燃烧源是PAH污染的主要贡献者。

尽管国际文献不断增长，现有研究仍存在一些方法论和背景上的局限性。许多研究依赖于间接生物标志物，如血清、尿液或母乳，这些可能无法准确反映PAHs在目标组织如乳腺脂肪中的长期积累。此外，样本量较小、对照组选择有限以及对潜在混杂因素如吸烟、饮食习惯和绝经状态的调整不充分，可能导致报告的关联性不一致。某些PAHs，如苯并[a]芘，也具有雌激素样活性，可以与激素信号通路相互作用，从而促进激素依赖性癌症如乳腺癌的发展。尽管全球证据不断积累，大多数现有的生物监测研究仍然集中在间接指标，如血清、尿液或母乳，而不是直接的组织测量，导致对乳腺脂肪组织中长期PAH积累的理解存在重要空白。

进一步，PAH暴露与个体人口统计学和生殖特征之间的相互作用仍不清楚。年龄、职业状况、教育水平、生育次数和初婚年龄等因素可能影响环境暴露程度和生物易感性，以及其后续影响。阐明这些关系对于识别暴露风险较高的群体和指导有针对性的预防干预至关重要。在伊朗，环境监测结果显示了显著的室内和室外PAH污染，特别是与交通、燃烧源和季节性因素有关。例如，一项关于德黑兰不同交通密度区域PM?.?结合PAHs的近期研究报告了低交通区域的平均浓度约为28.7 ± 20.1 ng/m3，而高交通区域约为41.1 ± 29.6 ng/m3。另一项在德黑兰三个城市站点进行的长期研究（2018-2019）发现，总PAHs（16个美国环保署优先PAHs）的浓度范围为24.6至38.9 ng/m3，秋季达到峰值，夏季浓度较低。室内研究也提供了有价值的信息。一项在伊朗的住宅空气监测研究发现，室内空气中的平均∑PAHs浓度约为1.26 ± 0.15 μg/m3，包括气相和颗粒相。尽管有这些环境暴露数据，但在伊朗尚无研究直接量化乳腺脂肪组织中的PAHs，这将是一个与健康相关的生物矩阵。此外，人口统计学、生殖和暴露相关变量（如年龄、生育次数、社会经济地位）在塑造PAH积累和乳腺癌风险中的调节作用仍未在该人群中探索。缺乏地区特异性、基于组织的数据构成了一个关键的空白，限制了针对性的公共卫生干预措施的发展。

因此，本研究对于提供乳腺脂肪组织中PAH污染的基线数据（一个与健康相关且较少研究的矩阵）至关重要，同时阐明环境和人口统计学因素如何共同影响乳腺癌风险，特别是在研究较少的中东人群中。认识到这一需求，本研究设计为伊朗首次直接量化17种PAH化合物在乳腺脂肪组织中的浓度。通过将直接化学测量与人口统计学因素相结合，本研究为理解环境暴露与宿主相关因素如何影响乳腺癌易感性提供了重要贡献，特别是在代表性不足的人群中。

研究方法包括采用医院为基础的病例对照设计，收集了196名女性的样本。病例组包括98名经组织病理学确诊的乳腺癌患者，无论肿瘤阶段或分子亚型。所有患者在接受化疗或放疗前被招募。对照组包括98名接受美容乳腺减容手术的女性，她们没有个人乳腺癌或其他恶性肿瘤史。样本量的估算基于比较癌症和非癌症组之间均值PAH浓度的统计功效计算。假设双侧显著性水平为0.05，统计功效为80%，预期标准差为0.10，以及最小可检测差异为0.04 μg/g，来源于之前发表的人类乳腺脂肪组织中PAH浓度数据。所需的最小参与者数量约为每组90人。为了确保足够的统计功效并考虑可能的数据丢失，每组最终纳入了98名参与者。

乳腺脂肪组织样本从Bisotun医院的病例组和Noor诊所及Hakim医院的对照组收集。所有参与者提供了书面知情同意，研究方案已通过Kermanshah大学医学科学伦理委员会的批准。除了样本收集，还通过标准化问卷收集人口统计学数据，问卷由参与者直接填写或通过结构化电话访谈完成。问卷收集了包括年龄、职业状况、生育次数、初婚年龄、教育水平和婚姻状况等变量。这些变量被定义为：年龄和初婚年龄作为连续变量（以年为单位）；生育次数作为离散整数变量；职业状况作为二分类变量（1 = 工作，0 = 家庭主妇）；教育水平作为四类有序变量（1 = 小于高中文凭，2 = 高中文凭，3 = 本科学位，4 = 研究生学位）；婚姻状况分为1 = 已婚、离婚或丧偶和0 = 未婚。超过90%的参与者是政府办公室工作人员。其余的是理发师或从事各种职业的自雇人员。总体而言，病例组中有两名参与者是未婚，而对照组中有三名参与者是未婚，其余的参与者均是已婚。

所有完成的表格经过人工审核，并输入到Microsoft Excel 2016中。在验证和清理后，数据被导入SPSS 25进行统计分析。乳腺脂肪组织样本（每份约1克）在手术切除后立即在无菌条件下收集，使用无菌不锈钢镊子和手术刀。样本从癌症患者的肿瘤部位附近宏观正常的脂肪区域和接受美容减容手术的对照组的外围脂肪区域中采集。每个样本被放入预标记的无菌聚丙烯冷冻管，密封以防止污染，并在收集后30分钟内立即转移到实验室。到达实验室后，样本经过视觉检查，去除任何结缔组织或血液残留，使用无菌纱布。清洁的组织随后在-80 °C下快速冷冻，并在该温度下保存，直到化学提取。在处理过程中，样本仅解冻一次以减少降解。为了均质化，冷冻组织被切成小块（<1毫米），并在冰浴中使用预冷却的玻璃均质器手动均质化，以确保均匀的组织结构。所有仪器和容器在使用前用正己烷预冲洗，以消除潜在的背景PAH污染。

对于化学分析，均质后的脂肪组织样本经过溶剂提取。每份约1克的样本与4毫升的正己烷混合，并涡旋3-5分钟。随后，加入2毫升的乙腈，并再次涡旋，然后在4,000 rpm下离心10分钟以实现相分离。上层有机相被小心收集，通过0.22 μm PTFE注射器过滤器过滤，并在高纯度氮气的温和气流下蒸发至最终体积为0.5毫升。

PAHs浓度在乳腺脂肪组织样本中通过气相色谱-质谱联用技术（GC-MS，Agilent Technologies 7890 GC与5975 MS检测器联用，美国）进行测定。目标化合物包括联苯（Beph）、苊烯（Acel）、苊（Ace）、芴（Flo）、菲（Phen）、蒽（Ant）、荧蒽（Flu）、芘（Py）、苯并[a]蒽（Ben）、?（Chr）、苯并[b]荧蒽（B[b]F）、苯并[k]荧蒽（B[k]F）、苯并[a]芘（B[a]P）、二苯并[a,h]蒽（DiAnt）、苯并[g,h,i]芘（BenPer）以及茚并[1,2,3-cd]芘（InPy）。色谱分离在HP-5MS毛细管柱（30米 × 0.25毫米 i.d.，0.25微米膜厚度）上进行，氦气作为载气，流速恒定为1.0毫升/分钟。注射器温度为280 °C，1微升的提取物以不分流模式注入。MS以电子轰击（EI）模式运行，70 eV，数据采集在选择离子监测（SIM）模式下，以最大化目标分析物的灵敏度。方法检测限（MDLs）范围从0.001到0.01 μg/g（干重），所有分析物浓度均高于其各自的MDLs。总PAHs（∑PAHs）被计算，并按三类划分：轻PAHs（2-3环：萘、联苯、苊烯、苊、芴、菲、蒽），中PAHs（4环：荧蒽、芘、苯并[a]蒽、?），重PAHs（5-6环：苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[a]芘、二苯并[a,h]蒽、苯并[g,h,i]芘、茚并[1,2,3-cd]芘。

校准标准溶液的准备和验证由执行GC-MS分析的认证分析实验室完成。标准溶液从Sigma-Aldrich提供的认证参考材料（CRM）中制备，以覆盖样本中的预期浓度范围。校准曲线使用每种化合物的五个浓度点构建，并通过相关系数（R2）大于0.995确认线性。

分析性能评估通过向空白脂肪组织样本中添加已知浓度的三种代表性PAHs（萘、?、苯并[a]芘）进行。添加是在低、中、高三个浓度水平进行的，并且这些添加样本经过与真实样本相同的提取和GC-MS处理。回收率范围从89%到106%，表明该方法在不同PAH亚类和浓度范围内提供了准确的定量。方法检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别为0.001到0.01 μg/g和0.003到0.03 μg/g（干重）。方法重复性通过重复分析添加的质量控制样本评估，所有目标化合物的相对标准偏差（RSDs）均低于10%。

所有统计分析使用SPSS 25进行。首先通过Kolmogorov–Smirnov检验评估PAH浓度分布的正态性。由于所有PAH变量均表现出非正态分布（p < 0.05），因此应用非参数统计方法。Mann–Whitney U检验用于比较乳腺癌病例与对照组之间的PAH浓度、连续和有序人口统计学变量如年龄、初婚年龄和子女数量。卡方检验用于比较两组之间的分类人口统计学变量，如婚姻状况、教育水平和职业。对于具有多个类别的变量（如教育水平），应用Kruskal–Wallis检验。连续人口统计学变量（如年龄、生育次数和初婚年龄）与PAH浓度之间的关系通过Spearman等级相关系数评估。由于在17种个体PAH化合物之间进行了多次比较，使用Benjamini–Hochberg虚假发现率（FDR）校正来计算调整后的p值，以控制第一类错误。

研究结果和讨论部分指出，本研究是伊朗首次直接量化17种PAH化合物在乳腺脂肪组织中的浓度，提供了组织层面的暴露证据，这在具有高环境风险因素的人群中具有重要意义。此外，与之前仅关注PAH浓度或仅关注流行病学因素的研究不同，我们的工作独特地将化学生物监测与人口统计学因素相结合，以解释癌症易感性。这种双重方法使得更全面地理解环境暴露和社会特征如何共同影响乳腺癌风险成为可能。

研究结果显示，病例组与对照组在总PAH浓度上存在显著差异，这可能反映了个体间环境暴露、生活方式和脂肪组成的实际异质性，而不是分析误差。数据集的视觉检查确认了右偏分布，少数参与者表现出较高的浓度（>30 μg/g），这与更大的暴露潜力一致（如使用固体燃料或生活在高交通区域的家庭主妇）。在排除这些极端值后，中心趋势保持稳定，证实了整体组间差异不是由异常值驱动的。使用非参数Mann–Whitney U检验进一步确保了这些比较的稳健性。分析显示，乳腺癌患者与非癌症对照组之间的PAH浓度存在显著差异。

总PAH负担在乳腺脂肪组织中明显更高，病例组的中位数浓度为0.045 μg/g，而对照组仅为0.005 μg/g（p < 0.001）。在分析的17种个体PAH化合物中，16种在癌症患者中表现出显著更高的浓度，唯一流出芴（p = 0.075）（表2，补充材料）。最显著的差异出现在高分子量PAHs中，如茚并[1,2,3-cd]芘和二苯并[a,h]蒽，这些均被美国环境保护局归类为可能的致癌物。这些发现表明，不仅总体的PAH负担，而且特定的致癌性PAHs的谱型可能与乳腺癌风险相关。

当将PAHs按分子量分类时，轻（2-3环）、中（4环）和重（5-6环）PAHs的浓度在病例组中均显著升高（每类p < 0.001）。这种模式表明，广泛的PAH暴露可能与乳腺癌风险相关，不限于特定的化合物类别。为了考虑在17种个体PAHs之间进行的多次比较，应用Benjamini–Hochberg FDR校正。调整后，16种PAHs仍保持统计学显著性（调整后的p < 0.05），证实了这些关联的稳健性。

这些结果与之前在西方人群中进行的研究一致（如Rundle等人，2000；White等人，2016），表明观察到的关联不是地理孤立的。在伊朗，室内空气污染来自传统烹饪实践和室外污染来自城市交通和燃料燃烧是常见的，这些发现尤其令人担忧。除了空气污染和燃烧相关排放，饮食摄入也可以代表PAH暴露的重要来源。最近的研究检测到咖啡和水果等常见食品中的可测量PAH水平，这可能增加这些化合物的总体身体负担。考虑到多种暴露途径——包括室内空气、室外排放和饮食来源——提供了更全面的环境PAH暴露和其在乳腺癌发生中的潜在作用的视角。这些结果也强调了减少燃烧相关污染物暴露的公共卫生策略的必要性，特别是在易受影响的人群中。

此外，病例组中PAH浓度的更大变异性（即标准差）可能反映了个体间代谢、生活方式或环境接触的差异，突显了进一步研究PAH吸收和生物积累的调节因素的重要性。

研究还发现，人口统计学因素与乳腺癌风险之间存在显著关联。例如，生育次数与较低的乳腺癌风险显著相关，表明每增加一个孩子，乳腺癌风险降低约52%。生育次数的保护作用在乳腺癌流行病学中已有广泛报道。反复怀孕会导致乳腺上皮细胞的持续激素变化，从而促进终末分化，使其对致癌性转化的易感性降低。哺乳，通常与高生育次数相关，可能通过雌激素抑制和物理清除受损细胞进一步降低风险。这一发现与全球文献一致，并加强了生殖保护的生物学合理性。

在本数据集中，乳腺癌患者平均年龄（51.7 ± 12.4岁）高于对照组（41.8 ± 8.9岁），这表明研究未进行年龄匹配。因此，年龄相关的逆向关联可能反映了采样结构的统计偏差，即对照组中年轻人比例较高。在这种受限的年龄分布中，年龄与风险的轻微下降可能显现，但并不与更广泛的流行病学模式相矛盾。

在伊朗和其他一些中等收入国家，乳腺癌通常在较年轻的中位年龄出现，而高收入国家的中位年龄较高。早期发病的乳腺癌在这些人群中往往表现出更具侵袭性的分子亚型（如三阴性或HER2阳性），这可能与PAHs等环境暴露更为紧密相关。因此，本研究中观察到的年龄相关模式不应被解释为衰老的保护作用，而是由于病例组中年轻、环境易感患者比例较高。

综合来看，我们的发现并不与全球公认的乳腺癌发病率随年龄增长的趋势相矛盾，而是强调了采样偏差和区域流行病学特征的影响。未来的研究应包括年龄匹配的对照组和按绝经状态或分子亚型进行分层，以明确年龄相关的风险模式。

研究还发现，人口统计学因素与PAHs浓度之间存在显著关联。例如，年龄与总PAHs浓度之间存在显著正相关（r = 0.286，p < 0.001）。这一关系在所有三种PAH亚类（轻、中、重）中均观察到，表明年龄可能作为PAHs生物积累的累积暴露相关因素。在化合物层面，某些特定的PAHs，如苊烯（r = 0.216，p = 0.002）、苊（r = 0.259，p < 0.001）、蒽（r = 0.179，p = 0.012）和茚并[1,2,3-cd]芘（r = 0.262，p < 0.001）均显示出显著的正相关。这些发现进一步支持了年龄增加导致低分子量和高分子量PAHs在脂肪组织中积累的生物学合理性。

年龄相关的这一发现具有一定的合理性。PAHs是脂溶性化合物，由于其在水中的溶解性差和代谢清除速度慢，容易在脂肪组织中积累。随着年龄增长，人体可能积累更多的PAHs，因为其暴露时间更长。此外，年龄相关的解毒和排泄机制下降，如细胞色素P450活性或肾清除能力的减少，也可能导致这种积累。

尽管在文献中存在有限的关于年龄与脂肪组织中PAHs浓度直接关系的研究，但本研究的结果与流行病学研究中发现的教育水平与多种疾病风险（包括乳腺癌）之间的关系一致。然而，本研究中未发现教育水平与乳腺癌风险之间的显著关联。这种差异可能由多种因素导致。

首先，教育水平在本人群中可能与年龄、职业状况或其他变量（如文化规范）存在混杂效应。例如，教育水平较高的家庭主妇可能仍然面临相似的室内污染风险（如烹饪燃料暴露），尤其是在传统或资源有限的环境中。其次，教育水平的分类可能掩盖了更细致的剂量反应关系。以前的研究中，使用更细致的分类（如受教育年限、识字水平或健康素养）通常显示出更强的关联性。最后，在某些地区，正式教育可能不一致地转化为改善健康素养或获得医疗保健服务的更好机会。这种差异可能解释了为什么本研究的结果与其他研究在教育水平与PAHs积累关系方面有所不同。

尽管在文献中关于教育水平与脂肪组织中PAHs积累的研究有限，但本研究的结果与流行病学研究中发现的教育水平与其他脂溶性有毒物（如多氯联苯（PCBs）和持久有机污染物（POPs））之间的关系一致。这些结果强调了在环境暴露评估中考虑社会决定因素的重要性，并提示改善低教育水平或易受影响人群的环境健康意识可能是有益的。

在本研究中，初婚年龄与乳腺癌风险之间没有显著关联（p = 0.597）。这表明，在本人群中，婚姻时间的早晚并不独立影响乳腺癌的发生可能性。这一发现与一些先前研究的结果相矛盾，那些研究发现较晚结婚或生育的女性乳腺癌风险增加，这可能是因为延迟的首次足月妊娠和长期的未受拮抗的雌激素暴露。例如，Clavel-Chapelon（2002）和Albrektsen等人（1995）发现，首次生育的早年与乳腺癌风险降低有关，特别是对于激素受体阳性的亚型。然而，需要注意的是，在所有人群中，婚姻年龄并不一定等同于首次生育年龄。文化、社会或个人因素可能导致婚姻与生育事件之间的延迟，削弱了婚姻年龄对乳腺组织暴露模式的直接影响。在本研究背景下，由于存在这种差异，婚姻年龄可能不足以作为生育激素历史的可靠代理。

总体来看，这些发现表明人口统计学因素通过双重机制影响女性健康：社会经济状况（就业和教育）塑造了环境污染物暴露，而生物因素（年龄和生育次数）调节了身体对这些暴露的激素和生理反应。认识到这些复杂的相互作用对于设计有针对性的预防干预措施至关重要，特别是对于家庭主妇和低教育水平的女性，她们可能更容易受到环境和社会决定因素的双重影响。

因此，本研究提供了重要的组织层面证据，显示伊朗女性乳腺脂肪组织中PAHs的浓度与乳腺癌风险之间存在显著关联。此外，研究还揭示了PAHs浓度受关键人口统计学因素的影响，包括年龄、生育次数、职业状况和教育水平。尽管某些变量，如就业和生育次数，与增加的PAH负担和更高的癌症风险相关，但其他变量，如教育水平，仅与暴露水平相关。这些模式强调了环境、生理和社会决定因素之间的复杂相互作用。例如，家庭主妇和教育水平较低的女性更可能具有较高的PAH浓度，这可能与她们在通风不良的室内环境中停留时间较长以及缺乏防护行为有关。相反，较高生育次数虽然与增加的暴露相关，但表现出对癌症的保护作用——这可能是因为妊娠带来的激素变化降低了恶性转化的易感性。这些发现强调了在乳腺癌预防框架中整合环境暴露评估的必要性。旨在减少PAH暴露的公共卫生策略，如改善室内通风、采用更清洁的燃料以及提高易受影响群体的环境健康意识，可能有助于降低癌症风险。