利用可点击氯氮平探针揭示药物蛋白加合物在粒细胞缺乏症中的作用机制

《Toxicology Letters》：A chemoproteomic strategy for identifying protein covalent binding targets of clozapine: an approach for advancing clozapine toxicity research

本文推荐氯氮平(CLOZ)所致粒细胞缺乏症机制研究新突破。研究人员合成"可点击氯氮平"(Click-CLOZ)探针，通过点击化学技术成功鉴定出髓过氧化物酶(MPO)、中性粒细胞防御素1(DEFA1B)等关键蛋白靶点，为阐明药物性粒细胞缺乏的免疫机制提供新工具。该研究发表于《Toxicology Letters》，对抗精神病药物安全性评价具有重要价值。

　　

氯氮平作为治疗耐药性精神分裂症的金标准药物，却因可能引发致命的粒细胞缺乏症而带有黑框警告。这种罕见但严重的副作用发生率约1%，但其分子机制数十年来始终成谜。目前主流理论认为，氯氮平经髓过氧化物酶(MPO)代谢生成的活性中间体与细胞蛋白共价结合，触发免疫反应是关键环节。然而，由于缺乏特异性捕获工具，直接证据一直难以获取。

为破解这一难题，研究团队创新性地设计合成了一种带有炔基标签的氯氮平类似物——Click-CLOZ。这种探针分子在保持原药代谢特性和生物活性的基础上，引入了点击化学官能团，犹如给氯氮平装上了"分子钩爪"，使其能够特异性地捕获并富集药物蛋白加合物。

研究团队通过核磁共振(NMR)和液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术确证了Click-CLOZ的结构完整性。代谢实验显示，Click-CLOZ与氯氮平在MPO/H₂O₂体系下产生完全相同的代谢谱，包括N-氧化物、氰化物加合物和谷胱甘肽(GSH)结合物等特征产物。细胞毒性实验进一步证实，Click-CLOZ对人早幼粒白血病细胞(HL-60)的毒性谱与氯氮平高度一致，说明结构修饰未改变其生物学性质。

关键技术方法包括：通过多步有机合成制备Click-CLOZ探针；利用MPO酶促反应和HL-60细胞模型模拟药物代谢；采用密度梯度离心法从健康志愿者血液中分离原代中性粒细胞；建立基于点击化学的生物素-链霉亲和素pull-down技术富集药物蛋白加合物；通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)进行蛋白质组学分析鉴定靶点蛋白。

3.1. Confirmation of Click-CLOZ chemical structure by LC/MS and NMR

研究人员通过优化合成路线，成功获得高纯度(97.5%)的Click-CLOZ，其化学结构经质谱(m/z 365.1524)和核磁共振氢谱(¹H NMR)确证，炔基标签的引入未影响母核结构。

3.2. CLOZ and Click-CLOZ are metabolized by MPO in a similar manner

代谢比较研究显示，Click-CLOZ与氯氮平在MPO催化下产生完全一致的氧化代谢模式，包括m/z 343/381(单氧产物)、359/397(双氧产物)和352/390(氰化物加合物)等特征离子峰，GSH捕获实验进一步证实两者反应性代谢物生成能力相当。

3.3. CLOZ and Click-CLOZ caused a similar degree of decreased HL-60 cell viability

细胞毒性评估表明，在0-60 μM浓度范围内，Click-CLOZ与氯氮平对HL-60细胞的活力抑制无显著差异，ADMET预测参数高度吻合，证明探针分子具有良好的生物学等效性。

3.4. Identification of Click-CLOZ bound proteins in HL-60 cells and neutrophils using a pull-down assay

蛋白质组学分析揭示，在HL-60细胞中，Click-CLOZ特异性结合髓过氧化物酶(MPO)、DNA复制许可因子MCM3、40S核糖体蛋白S16等15种蛋白(p<0.05)。在原代中性粒细胞中，显著富集中性粒细胞防御素1(DEFA1B)、组蛋白H4、中性粒细胞弹性蛋白酶(ELANE)等9种关键蛋白(Z-score>2)。STRING数据库分析显示，中性粒细胞中靶蛋白主要富集于中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)相关通路。

本研究首次成功开发出具有生物学活性的氯氮平化学探针，破解了药物蛋白加合物鉴定技术瓶颈。研究发现氯氮平可共价修饰MPO、DEFA1B等免疫相关蛋白，这些靶点富集于NETs形成通路，为"危险信号"理论提供分子证据。特别是MPO在两种细胞模型中均被显著捕获，提示药物可能通过修饰自身代谢酶而放大毒性效应。该探针工具为阐明药物性粒细胞缺乏的免疫机制开辟新途径，对抗精神病药物安全性评价和个体化用药具有重要转化价值。