鸡传染性支气管炎病毒LDT3/03株在CEF和Vero细胞中适应性传代致弱及其作为候选疫苗的潜力评估

《Virus Research》：Attenuation and altered replication of IBV strain tl/CH/LDT3/03 after serial passage in chicken embryo fibroblasts and Vero cells

本研究针对鸡传染性支气管炎病毒(IBV) tl/CH/LDT3/03株难以在细胞系中高效复制的问题，研究人员通过将其在鸡胚成纤维细胞(CEF)和非洲绿猴肾细胞(Vero)中分别连续传代20代(P20)和25代(P25)，成功获得了细胞适应性毒株CEA P20和VEA P25。全基因组测序揭示了病毒在传代过程中发生了包括S蛋白氨基酸替换、3‘UTR区197-nt缺失等关键变异。动物实验表明，细胞适应株在SPF鸡体内的复制能力和致病性显著降低，且in ovo（胚内）接种能提供针对亲本强毒株攻击的完全保护。该研究为开发基于细胞培养的IBV减毒活疫苗提供了新的候选株和理论依据。

　　

鸡传染性支气管炎（Infectious Bronchitis, IB）是由鸡传染性支气管炎病毒（IBV）引起的一种高度传染性的禽类疾病，给全球养禽业造成重大经济损失。IBV属于γ-冠状病毒属，其基因组为单股正链RNA，容易发生突变和重组，导致众多基因型/血清型并存，且交叉保护性差，这使得免疫防控面临巨大挑战。目前，商业化的IBV疫苗多为通过鸡胚连续传代致弱的活疫苗或灭活疫苗。然而，病毒在鸡胚中的增殖成本较高，且许多野外流行株难以在鸡胚中高效复制，更难以适应细胞培养，这限制了疫苗的研发和生产效率。因此，能否通过体外细胞培养体系驯化IBV流行毒株，获得遗传稳定、安全性好且免疫原性良好的减毒毒株，成为IBV疫苗研发领域的一个重要课题。

为了解决上述问题，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所的研究团队在《Virus Research》上发表了研究成果。他们选取了中国大陆广泛流行的肾脏致病型IBV毒株tl/CH/LDT3/03（简称LDT3/03），尝试将其适应于两种不同的细胞系：鸡胚成纤维细胞（CEF）和非洲绿猴肾细胞（Vero）。研究人员的目标是探究IBV在哺乳动物源细胞（Vero）中适应性进化的潜力，评估细胞适应株的生物学特性变化，并初步探索其作为减毒活疫苗候选株的可能性。

为开展本研究，研究人员运用了几项关键技术方法：一是病毒体外传代与驯化，将IBV LDT3/03株分别在CEF和Vero细胞中进行系列盲传；二是空斑试验，用于定量检测病毒滴度和观察病毒致细胞病变效应；三是全长基因组测序（Sanger法），对比分析亲本鸡胚适应株（EEA）与细胞适应株（CEA P20, VEA P25）之间的遗传变异；四是动物实验，使用SPF鸡评估病毒株的致病性、组织嗜性、排毒动态和免疫原性；五是血清学检测，包括病毒中和试验（VNT）和ELISA，用于评估免疫反应。

病毒在CEF和Vero细胞中的适应性传代及噬斑形态变化

研究人员将LDT3/03株在CEF和Vero细胞中分别连续传代至20代（P20）和25代（P25）。结果发现，随着传代次数的增加，病毒在两种细胞系中产生的噬斑逐渐变大且更清晰。特别是Vero细胞适应株VEA P25，在传代后期能产生巨大的噬斑，表明病毒在细胞中的复制效率和细胞间传播能力增强。这意味着IBV成功适应了在CEF和Vero细胞中复制，并可能伴随毒力相关性状的改变。

细胞适应株的全基因组序列分析

通过对EEA、CEA P20和VEA P25进行全基因组测序和比对，研究人员发现了丰富的遗传变异。最显著的变异包括：1）一个197核苷酸（nt）的缺失，位于3‘非翻译区（UTR），导致一个推测的非结构蛋白（由亚基因组mRNA 7编码）的编码序列被破坏，该缺失在CEA P20和VEA P25中均存在。2） 刺突蛋白（S）基因存在大量氨基酸替换，其中17个替换中有12个位于S1亚基，且多数（9个）为CEA P20和VEA P25所共有而与EEA不同，提示这些变化可能与细胞适应性及体内毒力减弱相关。3） VEA P25在膜蛋白（M）和5a蛋白之间的基因间隔区（ORF 4b）存在一个15nt的插入。4） 在非结构蛋白（如nsp3, nsp4, nsp13）以及5‘/3’ UTR区域也发现了多处核苷酸和氨基酸差异。这些遗传变异共同构成了病毒表型改变的物质基础。

细胞适应株对SPF鸡的致病性及复制能力评估

将EEA、CEA P20和VEA P25分别接种1日龄SPF鸡，观察临床发病情况并检测体内病毒复制。结果显示，EEA感染鸡只出现中度呼吸道症状，并在多种组织（呼吸道、消化道、肾脏、免疫器官）中检测到高水平的病毒RNA。相比之下，CEA P20仅引起轻微且短暂的临床症状，病毒复制水平和组织分布范围显著受限。VEA P25则完全不引起临床症状，其体内病毒复制量极低，仅在少数鸡的个别组织中可检测到。对咽拭子和泄殖腔拭子的病毒分离结果进一步证实，CEA P20和VEA P25在鸡体内的排毒量和排毒持续时间均远低于EEA。这些结果表明，细胞传代显著降低了LDT3/03株对鸡的致病性和体内复制能力。

细胞适应株的免疫原性及胚内接种保护效果

尽管毒力减弱，CEA P20和VEA P25仍能诱导鸡体产生针对亲本EEA株的病毒中和抗体，不过VEA P25诱导的抗体水平显著低于EEA和CEA P20，提示Vero细胞传代可能在一定程度上改变了病毒的抗原性。研究人员进一步评估了通过胚内接种（in ovo）方式接种CEA P20和VEA P25的安全性和免疫保护效果。虽然两种病毒接种对鸡胚孵化率有轻微影响，但孵出的雏鸡均健康无异常。攻毒保护试验表明，经胚内接种CEA P20或VEA P25的鸡只，在35日龄用强毒的EEA株攻击后，完全受到保护，不表现临床症状，且在攻毒后4天无法从呼吸道和消化道分离到攻击病毒，显示出完全的保护效果。

研究结论与意义

本研究成功地将一株野生的IBV流行株LDT3/03适应于CEF和Vero细胞系，获得了减毒的细胞适应株CEA P20和VEA P25。全基因组分析揭示了与细胞适应性和毒力减弱相关的关键遗传变异，特别是在S蛋白和3‘UTR区域。体内实验证实细胞适应株在鸡体内的复制和致病性显著降低，但通过胚内接种仍能诱导有效的免疫保护，抵抗亲本强毒株的攻击。

该研究的重要意义在于：首先，它证实了IBV能够适应哺乳动物源的Vero细胞，并在此过程中发生减毒，这为利用Vero细胞等细胞系生产IBV疫苗提供了可能性，有望降低对鸡胚的依赖和生产成本。其次，研究鉴定了与IBV细胞适应性和毒力相关的潜在遗传标记，为理解IBV的致病机制和减毒原理提供了新的线索。最后，研究初步证明了CEA P20和VEA P25，特别是CEA P20，作为胚内接种用减毒活疫苗候选株的潜力，为开发新型IBV疫苗奠定了基础。当然，这些候选疫苗株的遗传稳定性、大规模生产工艺以及针对不同流行株的交叉保护效力等，仍需进一步评估。