PROCR基因罕见错义变异的生物信息学分析：揭示血栓形成风险新机制

《Scientific Reports》：Bioinformatic analysis of rare endothelial protein C receptor missense variants associated with coagulation and thrombophilia risk

本研究通过整合生物信息学方法，对PROCR基因罕见错义变异进行系统性分析。研究人员利用多工具预测、进化保守性分析和蛋白质相互作用网络，鉴定出6个可能破坏EPCR功能的高风险变异（N64T、F93L、R113C、P145L、R173H、R236W）。研究发现这些变异通过影响蛋白质稳定性、翻译后修饰和相互作用网络，增加血栓形成风险，为血栓性疾病的精准风险评估提供了新见解。

　　

在血液的微妙平衡中，凝血系统如同精密的交响乐团，而内皮蛋白C受体（EPCR）则是其中一位关键指挥家。这个由PROCR基因编码的受体，通过调控蛋白C（PC）向活化蛋白C（APC）的转化，在维持血管稳定性和防止过度血栓形成中扮演着不可或缺的角色。然而，当PROCR基因发生突变时，这场精妙的交响乐可能陷入混乱，导致血栓形成倾向（thrombophilia）——一种血液异常凝固的疾病状态。

目前，虽然已知PROCR基因的常见变异rs867186（p.Ser219Gly）与静脉血栓栓塞（VTE）风险相关，但大多数PROCR错义变异的功能影响仍不明确。特别是那些罕见变异，由于在人群中频率较低，难以通过传统遗传学研究评估其临床意义。这种知识缺口限制了我们全面理解PROCR变异在血栓性疾病中的作用机制，也阻碍了精准医学在血栓风险评估中的应用。

为了解决这一问题，来自意大利坎帕尼亚大学的研究团队开展了一项创新的生物信息学研究，系统分析了PROCR基因的罕见错义变异。他们采用多学科整合方法，结合了文本挖掘、功能预测、结构建模和进化分析等多种计算生物学技术，旨在识别和表征可能影响EPCR功能的高风险变异。这项研究近期发表在《Scientific Reports》期刊上，为理解PROCR变异在血栓形成中的作用提供了新视角。

研究人员采用了几项关键技术方法：首先通过PubMed文本挖掘从237,357篇文章中筛选血栓形成相关蛋白；利用dbSNP数据库筛选PROCR基因罕见错义变异（MAF 0.0001-0.05）；应用SIFT、PolyPhen-2、PROVEAN和FATHMM等工具预测变异功能影响；使用REVEL、ClinPred和CADD进行致病性评分；通过I-Mutant2.0和MUpro评估蛋白质稳定性；借助PhyloP、PhastCons、GERP++和ConSurf分析进化保守性；利用MusiteDeep、PhosphoSitePlus和SwissPalm预测翻译后修饰（PTM）；运用AlphaFold进行结构建模；通过STRING数据库构建蛋白质相互作用网络；最后利用人类表型本体（HPO）进行临床表型关联分析。

文本挖掘和分析

文本挖掘分析发现，在血栓形成相关蛋白中，PROCR是最常被提及的蛋白，在标题中出现773次，在摘要中出现14,022次，凸显了其在凝血和血栓形成研究中的核心地位。其他重要蛋白包括SERPINC1（抗凝血酶，703次）和ADAMTS13（566次），而F2（凝血酶原）和PLG（纤溶酶原）也频繁出现，证实了它们在凝血途径中的重要性。

PROCR基因高风险nsSNPs的鉴定和功能影响

研究人员分析了12个PROCR基因的非同义单核苷酸多态性（nsSNP），通过四种计算工具（SIFT、PolyPhen-2、PROVEAN、FATHMM）评估其潜在致病效应。结果显示六个变异（N64T、F93L、R113C、P145L、R173H和R236W）被至少两种工具预测为有害，因此被选作进一步分析对象。REVEL、ClinPred和CADD评分进一步支持了这些变异的致病潜力，其中R113C显示最高的REVEL评分（0.114），而R236W虽然REVEL评分较低（0.114），但CADD评分较高（27.2），表明其可能的致病性。

nsSNPs对EPCR蛋白稳定性的影响

蛋白质稳定性分析显示，大多数变异对EPCR稳定性有负面影响。F93L、R113C和R173H被IMutant和MUpro一致预测为降低稳定性，其中R113C的影响最为显著（△△G = -3.06 kcal/mol）。N64T和P145L的预测结果存在工具间差异，需要实验验证。总体而言，这些变异可能通过破坏蛋白质稳定性而影响EPCR功能。

PROCR nsSNPs功能后果预测：聚集、淀粉样变性、分子伴侣结合和蛋白质稳定性

通过TANGO、WALTZ、LIMBO和FoldX等工具的分析发现，R113C变异显著增加蛋白质聚集倾向（dTANGO = +51.51），而P145L则显著降低分子伴侣结合倾向（dLIMBO = -45.55）。这些变化可能影响EPCR的正常功能和稳定性，进而影响其抗凝血活性。

EPCR变异对翻译后修饰的功能影响

翻译后修饰（PTM）分析显示，N64T直接破坏了一个实验验证的N-连接糖基化位点（N64），这可能影响蛋白质的正确折叠和膜定位。R173H和R236W位于已知磷酸化位点附近，可能间接影响磷酸化过程。这些PTM改变可能进一步影响EPCR的活性和调控。

EPCR高风险变异的结构影响：整合计算分析

整合MutPred、FoldX、HOPE、AlphaFold替代建模和二级结构预测分析，研究人员全面评估了六个优先变异的结构影响。F93L显示出最显著的去稳定化效应（ddG = +2.74 kcal/mol），而AlphaFold建模赋予其最高的致病性评分（0.9659）。二级结构预测显示，N64T、P145L和R173H引起显著的构象变化，包括从卷曲到螺旋和螺旋到链的转变，表明折叠动力学改变。

PROCR基因病原性变异的进化保守性和功能影响

进化保守性分析显示，N64T在脊椎动物（phastCons100way = 0.876）和哺乳动物（phastCons470way = 1）中具有最高的进化保守性。ConSurf分析进一步强调，N64（保守值8）和P145（保守值8）是暴露的功能残基，而F93具有最高的保守评分（9），是一个埋藏的结构残基。这些高度保守位置的突变可能显著影响EPCR稳定性、结构和功能。

PROCR基因的蛋白质相互作用

蛋白质相互作用（PPI）分析显示，PROCR与关键凝血蛋白存在强相互作用，包括F2（凝血酶原，评分0.987）、THBD（血栓调节蛋白，评分0.992）和F5（凝血因子V，评分0.94）。这些相互作用支持PROCR在凝血级联中的核心作用。此外，PROCR与CFH（补体因子H）的相互作用（评分0.593）表明其在连接凝血和免疫调节中的潜在作用。

PROCR基因突变的人类表型本体分析

人类表型本体（HPO）分析将PROCR变异与血栓形成和心血管异常相关联。R113C与最多的表型特征相关（HPO计数51），影响泌尿生殖系统、神经系统和视觉系统。F93L与心血管异常如心脏畸形和皮肤松弛相关，表明其在血管调节和凝血障碍中的作用。

本研究通过整合计算生物学方法，系统鉴定了PROCR基因中可能增加血栓形成风险的罕见错义变异。研究发现六个高风险变异（N64T、F93L、R113C、P145L、R173H和R236W）可能通过破坏蛋白质稳定性、翻译后修饰和蛋白质相互作用而损害EPCR功能。这些变异中，F93L显示出最高的预测致病性，而N64T和P145L影响高度保守的残基，可能对EPCR功能产生显著影响。

该研究的创新之处在于其综合性的分析方法，将进化保守性、结构生物学和临床表型数据相结合，提供了对PROCR变异功能影响的全面评估。研究结果不仅增进了我们对EPCR在凝血调节中作用的理解，也为血栓形成风险的遗传评估提供了新视角。鉴定的高风险变异可作为潜在生物标志物，用于血栓性疾病的个性化风险评估和靶向治疗策略开发。

尽管这项研究提供了重要的计算证据，但作者强调实验验证的必要性。未来研究应着重于这些变异在人群中的流行病学调查，以及它们对EPCR功能和凝血平衡的实验验证。此外，需要在更多样化的人群中验证这些发现，以克服当前遗传研究中人群代表性不足的限制。

这项研究展示了计算生物学在识别和优先排序功能相关遗传变异方面的强大能力，为理解复杂疾病如血栓形成的遗传基础提供了新范式。通过将生物信息学预测与实验验证相结合，我们可以更好地理解遗传变异如何贡献于疾病风险，最终推动精准医学在血栓性疾病中的应用。