内生真菌来源的植物鞘氨醇通过诱导氧化应激和细胞凋亡抑制乳腺癌细胞增殖的机制研究

《Scientific Reports》：Phytosphingosine, a sphingolipid isolated from fungal endophyte Penicillium oxalicum, exerts cytotoxic effects against breast cancer cells and shows blood compatibility

本研究针对乳腺癌治疗中药物毒副作用大、易产生耐药性等问题，从药用植物内生真菌Penicillium oxalicum的乙酸乙酯提取物中分离纯化出关键活性成分植物鞘氨醇（Phytosphingosine）。通过体外实验证实，该化合物可选择性抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231和激素依赖性乳腺癌MCF-7细胞增殖，并诱导NO介导的氧化应激与细胞凋亡，且对正常细胞（HEK-293）和红细胞表现出良好生物相容性。该研究为开发新型真菌源抗乳腺癌先导化合物提供了理论依据。

　　

乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率居高不下，尤其是三阴性乳腺癌（TNBC）因缺乏特异性治疗靶点，易复发转移，临床预后极差。当前化疗药物存在毒副作用强、易产生耐药性等问题，亟需开发新型高效低毒的抗癌药物。自然界中的微生物资源，特别是与药用植物共生内生真菌，因其能够产生结构新颖、活性多样的次级代谢产物，已成为抗癌药物研发的重要宝库。

在这项发表于《Scientific Reports》的研究中，印度巴纳拉斯印度大学（Banaras Hindu University）的Vibhav Gautam团队从药用植物内生真菌Penicillium oxalicum的乙酸乙酯提取物中成功分离纯化出关键活性成分植物鞘氨醇，并系统评价了其抗乳腺癌活性及作用机制。

关键技术方法概述

研究采用乳腺癌细胞系MDA-MB-231（三阴性）和MCF-7（激素依赖性），以及正常人胚肾细胞HEK-293。通过细胞增殖实验（结晶紫染色）和细胞毒性实验（MTT法）筛选活性成分；利用高效液相色谱（HPLC）分离纯化化合物，结合液相色谱-质谱联用（LC-MS）、核磁共振（NMR）和傅里叶变换红外光谱（FT-IR）进行结构鉴定；通过DAPI核染色观察细胞凋亡形态，Griess法检测一氧化氮（NO）水平，溶血实验评估血液相容性。

研究结果

1. 乙酸乙酯提取物抑制乳腺癌细胞增殖

研究发现，Penicillium oxalicum的乙酸乙酯提取物可浓度依赖性地抑制MDA-MB-231和MCF-7细胞增殖。在MDA-MB-231细胞中，IC₃₀、IC₅₀和IC₇₀浓度下的细胞增殖率分别为95.13%、79.4%和53.68%；在MCF-7细胞中分别为88.62%、76.71%和61.47%。这表明该提取物具有显著的抗乳腺癌活性。

2. LC-MS分析揭示50种潜在活性成分

通过LC-MS技术从乙酸乙酯提取物中鉴定出50种化合物，其中植物鞘氨醇、呋喃衍生物等已知具有抗癌活性的成分被重点关注，提示这些化合物可能是其抗乳腺癌活性的物质基础。

3. HPLC分离获得高活性组分

HPLC分析在366 nm波长下发现两个主要色谱峰（保留时间23.931 min和26.242 min）。活性导向分离发现第二个组分（HPLC fraction 2）对MDA-MB-231和MCF-7细胞的IC₅₀分别为39.79 μg/mL和23.74 μg/mL，而对正常HEK-293细胞的IC₅₀为125.55 μg/mL，表现出显著的选择性毒性。

4. 活性组分诱导NO介导的氧化应激

HPLC fraction 2处理可浓度依赖性地升高乳腺癌细胞内NO水平。在MDA-MB-231细胞中，IC₃₀、IC₅₀和IC₇₀浓度下NO水平分别为19.203 μM、24.227 μM和27.716 μM；在MCF-7细胞中分别为18.782 μM、19.265 μM和21.591 μM。NO的升高与细胞凋亡形态变化相关，表明其可能通过氧化应激途径诱导细胞死亡。

5. 结构鉴定确认活性成分为植物鞘氨醇

通过高分辨质谱（HR-MS）、FT-IR和NMR分析，确定HPLC fraction 2的化学结构为(2S,3S,4R)-2-氨基十八烷-1,3,4-三醇，即植物鞘氨醇。其分子式为C₁₈H₃₉NO₃，分子量为317.5 g/mol。FT-IR显示3285 cm^-1（O-H伸缩）、2938 cm^-1（N-H伸缩）等特征吸收峰，与植物鞘氨醇结构一致。

6. 植物鞘氨醇诱导乳腺癌细胞凋亡

DAPI染色显示，植物鞘氨醇处理后的乳腺癌细胞出现核固缩、核碎裂等典型凋亡形态变化，且呈浓度依赖性。这表明植物鞘氨醇通过诱导细胞凋亡抑制乳腺癌生长。

7. 植物鞘氨醇具有良好的血液相容性

溶血实验表明，植物鞘氨醇在≤125 μM浓度下对红细胞无明显毒性，溶血率<5%；仅在≥250 μM高浓度时才引起显著溶血。这表明其在治疗浓度下具有良好生物安全性。

结论与意义

本研究首次从内生真菌Penicillium oxalicum中分离鉴定出植物鞘氨醇，并证实其可通过诱导NO介导的氧化应激和细胞凋亡，选择性抑制三阴性乳腺癌和激素依赖性乳腺癌细胞增殖。该化合物对正常细胞和红细胞表现出低毒性，具有成为新型抗乳腺癌先导化合物的潜力。研究不仅为乳腺癌治疗提供了新的候选药物，也凸显了内生真菌在抗癌药物开发中的重要价值。未来需进一步开展体内药效评价及分子机制深入研究，推动其向临床应用转化。