肠道病毒基因组招募3CD蛋白进行负链RNA合成的结构基础

本研究解析了柯萨奇病毒B3型5′末端cloverleaf (CL) RNA与病毒3C蛋白酶复合物的高分辨率晶体结构，揭示了sD茎环作为3CD招募的关键结构域。研究发现两个3C单体通过识别sD茎的侧向表面特异性结合，且3D结构域不参与结合，而连接区可能增强3C与CL的相互作用。该工作为靶向病毒复制机制的广谱抗病毒药物设计提供了结构框架。

　　

肠道病毒是一类单股正链RNA病毒，能够引起多种人类疾病，包括普通感冒、脊髓灰质炎、急性弛缓性麻痹、无菌性脑膜炎和心肌炎。这些病毒的基因组5′和3′非翻译区（UTR）包含模块化RNA结构，负责调控病毒蛋白翻译和基因组复制。当病毒基因组在感染过程中释放到细胞质中，5′UTR内部的内部核糖体进入位点（IRES）会招募宿主细胞机制进行蛋白翻译。当病毒蛋白充足时，病毒蛋白酶会切割与IRES结构域结合的宿主蛋白因子（如PCBP2），从而停止翻译并启动基因组复制。

在这一过程中，病毒3CD蛋白（3C蛋白酶和3D RNA依赖的RNA聚合酶的前体）与宿主PCBP2结合到病毒基因组最5′端的cloverleaf（CL）样RNA上。宿主poly(A)结合蛋白（PABP）结合在3′UTR，随后与CL-3CD-PCBP2三元复合物相互作用，促进基因组环化。这一组装过程招募尿苷酰化的病毒蛋白VPg作为引物，形成具有复制能力的起始复合物。最后，3CD通过反式自切割产生有活性的3D聚合酶，延伸引物合成负链（-）RNA。负链RNA随后作为模板合成正链基因组RNA。值得注意的是，由于活跃的基因组RNA会被抑制复制，反之亦然，CL结构域也被认为是调控病毒基因组翻译和复制的分子开关。然而，这些关键病毒学过程的结构和机制仍不清楚。

为了解决这些问题，研究人员以柯萨奇病毒B3型（CVB3）为模型，利用Fab辅助的RNA晶体学技术，解析了完整的CL-3C复合物以及分离的sD-3C复合物的晶体结构，分辨率分别达到2.69 ?和2.41 ?。通过等温滴定量热法（ITC）和生物层干涉技术（BLI）等生物物理方法，并结合位点定向突变，深入研究了3C、3D和3CD与来自7种不同肠道病毒物种的CL之间的相互作用。该研究发表于《Nature Communications》。

研究主要应用了以下关键技术：X射线晶体学用于解析蛋白质-RNA复合物结构；等温滴定量热法（ITC）用于定量分析结合亲和力；生物层干涉测量法（BLI）用于实时监测分子间相互作用；分子置换和迭代模型构建用于晶体结构解析；AlphaFold3用于预测3CD蛋白的三维结构；以及位点特异性突变技术用于验证关键相互作用位点。

Crystallization and structure determination of CVB3 CL-3C complex

研究人员成功解析了CVB3完整5′ CL（90个核苷酸）以及分离的sD茎环（36个核苷酸）与3C蛋白的复合物晶体结构。CL-3C复合物在C121空间群中结晶，分辨率为2.69 ?；sD-3C复合物在P2₁2₁2₁空间群中结晶，分辨率为2.41 ?。结构解析表明，每个RNA分子结合两个3C单体（称为3C1和3C2），且sD-3C结构与完整CL-3C复合物中的相应区域几乎相同（RMSD = 0.64 ?），证明sD茎环是3C结合的唯一决定因素。

Composition of CL-3C and sD-3C complexes

晶体结构分析显示，两个3C分子以单体形式结合到单个RNA分子上，彼此之间没有显著的相互作用。尺寸排阻色谱（SEC）实验证实3C在溶液中以单体形式存在，并且CL-3C复合物存在1:2和1:1两种结合化学计量比。sD环的突变（C63G, C65G, G66A）仅影响一个3C结合位点，进一步支持了3C以单体形式结合的观点。

Structural features of the CL-3C complex

与未结合的CL和3C结构相比，复合物结构没有发生显著的构象变化（RMSD分别为1.86 ?和0.34 ?），表明3C是结合到一个预先折叠的RNA支架上。3C蛋白采用糜蛋白酶样折叠，其RNA结合界面由N端α-螺旋以及L1和L2环构成。两个3C分子分别主要识别sD茎环的环区域（靠近顶端四环）和凸起区域（靠近二核苷酸凸起），并沿着sD茎的螺旋轴相对排列，通过静电作用和氢键网络识别sD茎的侧向表面。

Binding studies with CL and 3C mutants

通过ITC结合实验验证了关键核苷酸和残基的作用。sD环内的G66C突变使结合亲和力降低超过15倍，而将sD环突变为GAGA四环（C63G, C65G, G66A）也显著降低亲和力，表明UNCG型四环构象对3C识别至关重要。关闭环的U62•G67摆动碱基对的突变则完全消除了结合。用经典碱基对替换sD茎中的非经典嘧啶-嘧啶（Py•Py）螺旋会使结合亲和力降低约5倍，表明Py•Py螺旋的较窄宽度对于形成合适的3C结合表面至关重要。在3C蛋白中，R13A突变完全消除了结合，K156A突变使亲和力降低约50倍，突出了这些残基在结合中的关键作用。

Comparison of 3C interactions among enteroviral CLs

CVB3 3C能够与脊髓灰质炎病毒1型（PV1）、肠道病毒D68型（EVD68）、鼻病毒A2型（RVA2）和鼻病毒C15型（RVC15）的CL以相似的亲和力结合，但不能与鼻病毒B14型（RVB14）和肠道病毒71型（EV71）的CL结合。相反，RVB14 3C能够与所有测试的7种肠道病毒CL结合，而EV71 3C则不能结合RVA2和RVB14的CL。这些结果表明，3C与CL的识别更依赖于结构模式的识别，而非特定序列，其特异性源于sD和3C结合界面三维结构的细微差异。

Interactions of 3CD with enteroviral CLs

BLI结合实验表明，3CD与CL的结合亲和力（K_d = 0.67 ± 0.1 μM）比3C单独存在时（K_d = 1.03 ± 0.3 μM）高出约2倍，而3D结构域本身与CL没有可检测的结合活性。AlphaFold3预测的CVB3 3CD结构模型以及其与PV1 3CD晶体结构的比对表明，3D结构域不直接与CL相互作用，但连接3C和3D的柔性连接区可能靠近CL的sD螺旋，提供额外的相互作用。在连接区引入E190A和K193A双点突变的3CD（3CD-Mut）与CL的结合亲和力降低了约3倍，支持了连接区在增强结合中的作用。

讨论与结论

该研究通过高分辨率结构生物学和生物物理方法，阐明了肠道病毒5′ cloverleaf（CL）RNA招募病毒3CD蛋白进行负链RNA合成的分子机制。研究发现，sD茎环是3C/3CD结合的唯一决定因素，两个3C单体以单体形式结合，分别识别sD茎的环侧和凸起侧，主要与RNA骨架相互作用，并依赖于Py•Py螺旋所塑造的独特大沟结构。3D结构域不直接参与CL结合，但3CD中连接3C和3D的柔性连接区可能提供额外的相互作用，从而解释其比单独3C更高的亲和力。研究还揭示了3C与不同肠道病毒CL结合的交叉反应性和特异性是由结合界面细微的结构差异所决定的。

这项工作为理解肠道病毒基因组复制的关键步骤提供了原子级别的结构框架，澄清了先前关于3C二聚化以及3D结构域在CL结合中作用的争议。由于CL和3CD蛋白在肠道病毒中高度保守，所阐明的结合机制具有普遍性。该研究不仅解释了大量的前期生物化学、病毒学和细胞观察结果，而且为开发靶向这一核糖核蛋白（RNP）平台、旨在干扰病毒复制的广谱抗病毒药物（尤其是针对3C和3D这两个经过充分验证的靶点）奠定了结构基础。考虑到该平台的高度保守性，开发能够治疗多种肠道病毒感染的新型通用疗法成为可能。