靶向肝脏生物钟联合酪氨酸激酶抑制逆转晚期肝细胞癌的机制与治疗策略研究

《Cell Reports》：Targeting the hepatic circadian clock concomitant with tyrosine kinase inhibition reverses late-stage hepatocellular carcinoma

本研究针对晚期肝细胞癌(HCC)患者对酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)反应有限的临床难题，通过揭示P2-HNF4α/BMAL1昼夜节律轴在肝癌代谢重编程中的关键作用，发现天然黄酮类化合物诺比拉亭(NOB)可通过激活RORα/BMAL1通路特异性抑制BMAL1缺陷型HCC。尤为重要的是，NOB与索拉非尼(SOR)或乐伐替尼(LEN)联用展现显著协同抑瘤效应，并通过多组学分析证实该联合疗法可同时调控CPT1A介导的脂肪酸氧化、胆固醇代谢和氨基酸转运等多条代谢通路。该研究不仅为HCC的精准分型提供了新型生物标志物CPT1A，更开创性地提出基于昼夜节律的时序化疗策略，为晚期HCC治疗提供了新范式。

　　

在全球肝癌发病率持续攀升的背景下，肝细胞癌(HCC)因其高死亡率成为严峻的公共卫生挑战。尤其令人担忧的是，多数患者确诊时已处于晚期阶段，现有治疗方案如酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)和免疫检查点抑制剂均面临患者反应率有限的瓶颈。这一临床困境背后，潜藏着对HCC分子分型认知不足和治疗策略单一化的根本问题。

值得关注的是，近年研究发现约50%的HCC病例呈现独特的分子特征：肿瘤细胞中大量表达胚胎型P2-HNF4α异构体，同时伴随核心昼夜节律转录因子BMAL1的显著缺失。这一反常现象引起了德克萨斯大学健康科学中心Baharan Fekry博士团队的好奇——是否可以利用癌细胞这一"生物钟缺陷"特性开发新型治疗策略？为此，他们聚焦于天然小分子化合物诺比拉亭(NOB)，这种从柑橘类植物中提取的黄酮类物质已被证实具有激活昼夜节律的作用。研究团队设想：能否通过NOB重塑肿瘤细胞的生物节律，进而增强现有靶向药物的疗效？

为验证这一假说，研究人员构建了模拟人类HCC进展的STAM小鼠模型（新生期注射链脲佐菌素后给予高脂饮食），该模型成功再现了P2-HNF4α表达逐渐升高而BMAL1表达下降的病理特征。通过体外实验发现，NOB能特异性诱导BMAL1缺陷型肝癌细胞（如HepG2、原代小鼠HCC细胞）中BMAL1表达，此过程依赖RORα受体介导。机制上，NOB不仅上调BMAL1，还显著抑制P2-HNF4α表达，并降低AKT(Ser⁴⁷³)磷酸化水平，提示其可能通过调控AKT信号通路抑制肿瘤进展。

研究进一步揭示，NOB与临床常用TKIs（索拉非尼、乐伐替尼）联用产生显著协同效应。即使在索拉非尼耐药的Hep3B和Huh7细胞系中，低剂量联合用药仍能有效抑制细胞增殖和迁移。RNA测序分析显示，联合治疗组相比单药治疗显著改变4,376个基因表达，涉及昼夜节律导引、TGF-β信号、VEGF信号等关键通路。在动物实验中，NOB（200 mg/kg隔日给药）与低剂量索拉非尼（10 mg/kg每日）联合治疗四周，使STAM模型小鼠肿瘤发生率降至10%以下，且雌性个体完全抑制肿瘤形成。

通过整合转录组学与代谢组学数据，团队发现P2-HNF4α过表达直接导致胆固醇代谢物、必需氨基酸和中长链酰基肉碱水平升高。特别值得注意的是，CPT1A（肉碱棕榈酰转移酶1A）作为脂肪酸氧化的限速酶，在P2-HCC中显著上调，且与P2-HNF4α表达呈正相关（R=0.836）。染色质免疫共沉淀证实P2-HNF4α可直接结合CPT1A、CYP27A1等基因的DR1位点。临床样本分析进一步验证，HCC患者血清CPT1A水平与肿瘤组织P2-HNF4α表达呈正相关，提示血清CPT1A可作为P2-HNF4α阳性HCC的非侵入性生物标志物。

研究还创新性地引入时序化疗概念。通过同步化HepG2细胞发现，CPT1A表达呈现昼夜波动，峰值出现在ZT17左右。在免疫缺陷小鼠移植瘤模型中，ZT20（活动期晚期）给药的抑瘤效果显著优于ZT8（休息期晚期），表明依据生物节律给药可优化治疗效果。线粒体功能分析显示，同时敲低P2-HNF4α和CPT1A可显著降低HepG2细胞基础呼吸能力和ATP产量，证实二者在调控肿瘤细胞能量代谢中具有协同作用。

本研究主要采用STAM小鼠疾病模型、细胞同步化技术、RNA测序、染色质免疫共沉淀(ChIP)、靶向/非靶向代谢组学、海马线粒体应力检测等关键技术，并纳入21例HCC患者匹配组织与血清样本进行临床验证。

研究结果

NOB有效靶向P2-HNF4α表达的HCC

体外实验表明，NOB通过RORα依赖性方式特异性诱导BMAL1缺陷型肝癌细胞中BMAL1表达，同时抑制P2-HNF4α表达。在BMAL1高表达的Hepa1c1c7细胞中，NOB未显现显著效应，证实其作用具有肿瘤特异性。

NOB预防STAM模型中HCC形成

动物实验显示，NOB干预显著改善STAM小鼠生存率（p=0.0036），降低肿瘤发生率和每肝肿瘤数量。分子层面，NOB上调Bmal1、Pten等抑癌基因，下调Snai1、Myc等促癌基因表达。

TKIs与NOB联用展现协同效应

Bliss协同模型证实NOB与低剂量索拉非尼或乐伐替尼联用产生协同/叠加效应。迁移实验表明联合治疗较单药显著抑制癌细胞侵袭能力。

RNA-seq揭示协同作用分子机制

联合治疗组差异表达基因数量（4,376个）远超单药组，通路富集分析显示昼夜节律、细胞周期、TGF-β信号等关键通路被显著调控。

联合治疗抑制HCC进展

STAM模型中，NOB+索拉非尼联合治疗使雄性动物肿瘤发生率降至<10%，雌性降至0%。病理评估显示肝细胞气球样变和微泡性脂肪变性显著改善。

代谢组学揭示代谢改善机制

HCC组血清中胆固醇代谢物、必需氨基酸和酰基肉碱水平显著升高。联合治疗协同降低LDL和甘油三酯水平，逆转肿瘤代谢异常。

组学整合揭示作用机制

联合治疗显著下调ANGPTL3、TUBB2B等HCC生存相关基因，同时抑制氨基酸转运体（SLC7A6、SLC38A2）和CPT1A表达。ChIP实验验证P2-HNF4α直接调控CPT1A等代谢基因。

P2-HNF4α过表达升高HCC相关代谢物

P2-HNF4α过表达肝细胞再现STAM模型代谢特征，包括胆固醇硫酸酯、缬氨酸和亮氨酸等代谢物升高，证实P2-HNF4α驱动代谢重编程。

时序化疗优化治疗效果

同步化细胞实验显示联合治疗效果存在昼夜差异。动物实验中ZT20给药抑瘤效果最佳，为临床时序给药提供实验依据。

结论与讨论

本研究系统阐明了P2-HNF4α/BMAL1轴在HCC发生发展中的核心作用，首次发现天然化合物NOB可通过重塑肿瘤生物钟特异性靶向BMAL1缺陷型HCC。创新性地提出NOB与TKIs联合治疗方案，不仅克服了单药治疗耐药性问题，还通过多靶点调控代谢重编程增强疗效。此外，血清CPT1A作为P2-HNF4α阳性HCC生物标志物的发现，为临床患者分层提供了便捷工具。

尤为重要的是，该研究将时序化疗概念引入HCC治疗领域，证明依据生物节律给药可显著提升疗效，为个体化治疗开辟新方向。尽管研究未验证NOB与免疫检查点抑制剂的联用效果，但低剂量TKI即可显效的特点提示该方案可能降低临床毒副作用。未来研究需进一步明确酰基肉碱代谢在HCC不同阶段的动态变化，以及时序化疗在人体中的最佳时间窗口。

这项发表于《Cell Reports》的研究不仅深化了对HCC代谢异质性的认知，更开创了"生物钟靶向治疗"的新范式，为晚期HCC患者提供了从分子分型到时序给药的全程精准医疗解决方案。