靶向冠状动脉疾病相关基因绘制平滑肌细胞动脉粥样硬化形成机制图谱

《iScience》：Mapping atherogenesis mechanisms in smooth muscle cells by targeting genes linked to coronary artery disease

本研究针对冠状动脉疾病（CAD）中平滑肌细胞（SMC）致病机制不清的问题，通过整合GWAS和scRNA-seq数据筛选出20个在SMC中具潜在作用的CAD风险基因。研究人员通过体外siRNA干扰、RNA-seq及功能实验，发现这些基因扰动共同调控了收缩、细胞周期、NF-κB和干扰素等通路，且风险基因变异增强了胆固醇诱导的信号。研究揭示了SMC中多基因调控的动脉粥样硬化机制，并证明GWAS效应方向有助于跨基因和细胞类型确定后续功能研究的细胞通路优先顺序，为SMC靶向治疗提供了新见解。

　　

动脉粥样硬化性心血管疾病是全球范围内导致死亡和残疾的主要原因，尽管现有的降脂等疗法有效，但仍存在显著的残余风险。血管平滑肌细胞（SMC）在动脉粥样硬化过程中发生表型转换，失去其静止的收缩表型，转化为多种间充质细胞类型，这一过程是斑块生长和不稳定的关键决定因素。然而，SMC中驱动疾病的分子通路尚不明确，这阻碍了其作为药物靶点的开发。近年来，全基因组关联研究（GWAS）已将许多在血管细胞中活跃的遗传位点与冠状动脉疾病（CAD）联系起来，暗示SMC及其衍生的间充质细胞是潜在的介质。尽管如此，对这些风险基因如何共同调控SMC通路仍缺乏系统性的理解。

为了回答这些问题，研究人员在《iScience》上发表了他们的研究成果。他们开展了一项整合遗传学与功能基因组学的研究，旨在揭示SMC中与人类动脉粥样硬化遗传相关的共享机制。研究的主要技术方法包括：利用公共GWAS数据库（如CVDKP和FinnGen）和Open Targets Genetics平台进行CAD风险基因筛选；整合已发表的三个人类动脉粥样硬化斑块单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集（共50,390个细胞）以确定基因在SMC/间充质细胞中的富集表达；使用人主动脉SMC进行体外功能实验，通过siRNA敲低20个选定基因，并在基线、胆固醇超载（使用水溶性胆固醇处理）和机械牵张（10%伸长，1Hz，6小时）三种疾病相关条件下培养细胞；通过高通量RNA测序（RNA-seq）分析敲低后的转录组变化（共345个样本）；并利用SCENIC、基因集富集分析（GSEA）、共表达网络分析（WGCNA）以及孟德尔随机化等方法进行生物信息学分析，以推断调控网络、通路活性和基因的因果效应方向。

识别在SMC中具有潜在作用机制的GWAS基因

研究人员首先从GWAS中识别出与低密度脂蛋白（LDL）胆固醇无关的CAD相关基因组变异，通过多种变异到基因的映射策略，初步筛选出368个候选基因。通过分析整合后的人类动脉粥样硬化斑块scRNA-seq数据，他们发现一个大的间充质细胞超簇（包含15,018个细胞），其中包括具有收缩、成纤维细胞、周细胞、过渡型、纤维肌细胞和骨软骨表型的细胞。最终，他们选择了20个基因进行深入研究，这些基因在斑块间充质细胞中表达丰富，且代表了多种潜在功能。空间转录组学数据进一步证实，许多选定基因在人类冠状动脉斑块和中膜区域表达。

用于评估人平滑肌细胞功能的细胞实验模型的建立

为了在动脉粥样硬化斑块相关的SMC表型中测试基因功能，研究人员将人主动脉SMC置于三种条件下：基线（标准培养，细胞自发调制）、胆固醇超载（用水溶性胆固醇处理72小时，诱导泡沫细胞样状态）和机械牵张（10%循环牵张6小时，诱导更收缩的表型）。RNA-seq分析证实，胆固醇超载上调了炎症基因和胆固醇流出基因，并下调了收缩基因；而机械牵张则下调了炎症基因并上调了部分收缩基因。细胞状态去卷积分析表明，这些体外条件在一定程度上诱导了与体内动脉粥样硬化病变中观察到的相关的细胞状态。

冠状动脉疾病相关基因在人SMC中的敲低效果

研究人员通过siRNA敲低了每个选定的20个靶基因，并在三种条件下对细胞进行了转录组分析。主成分分析（PCA）显示了不同条件之间的转录组差异。与对照组相比，在基线和胆固醇加载条件下，差异表达基因（DEG）的数量多于机械牵张条件。大多数靶基因的敲低效率较高，并且RNA-seq数据还揭示了靶基因之间的相互调控。

靶基因敲低后平滑肌细胞通路的调控

基因集富集分析显示，靶基因敲低主要调控了细胞周期、干扰素信号、炎症细胞因子和Rho GTPases等通路。对定制的SMC功能相关基因特征（如收缩、细胞外基质、细胞周期和炎症反应）的分析表明，多个靶基因调控了与SMC收缩、细胞外基质合成、细胞周期、NF-κB和I型干扰素通路相关的基因集。对于一部分靶基因，特定信号通路的调控在不同的细胞状态下是一致的，但许多调控具有情境依赖性，仅在一种或两种 examined 细胞状态下被检测到，有时甚至方向相反。这提示某些机制在不同细胞状态下的重要性会发生变化。

炎症和细胞周期相关调控子的广泛改变

为了识别驱动不同敲低之间共享转录组变化的转录因子（TF），研究人员分析了差异表达基因中富集的调控子（regulon），并将分析限制在人类斑块scRNA-seq数据中显示活跃的调控子。他们发现，推测由细胞周期/增殖（如E2F3、E2F4、ETS1）和免疫/NF-κB（如IRFs、STAT、RELA）TF控制的调控子显著富集。此外，AP-1复合物（FOS和JUN）、SOX和Kruppel样因子等已知的SMC表型调节因子也被识别出来。

常见SMC标记基因和功能读数的独立调控

研究人员检查了用于定义SMC表型的多种标记基因的表达水平，包括收缩基因标记物、调制的SMC标记物、细胞增殖标记物、NF-κB活化标记物和I型干扰素诱导基因。在基线条件下，收缩标记物基因表达被广泛调控，但所选的调制SMC标记物（FN1、KLF4、LUM）通常被独立调控，并且不一定在收缩基因被抑制时上调，反之亦然。同样，收缩基因和增殖标记基因之间也没有观察到一致的相互调控。此外，虽然NF-κB和I型干扰素信号标记物被多个靶基因调控，但那些减弱炎症信号的敲低并不一定是上调调制SMC标记物的相同敲低。在功能上，几乎所有靶基因的敲低都下调了增殖（通过EdU标记测量），而仅在ADAMTS7敲低中检测到细胞迁移（划痕实验）的显著差异。这表明，在培养的SMC中，收缩基因表达与增殖、调制和炎症信号的标记/功能读数并非紧密相互依赖。

胆固醇超载的促动脉粥样硬化效应由GWAS基因效应方向指示

通过将GWAS效应方向与体外功能数据整合，研究人员发现，胆固醇诱导的基因反应具有促动脉粥样硬化机制的特征。在调控胆固醇诱导基因的基因敲低中，预测为保护性基因的敲低后出现上调，而预测为有害基因的敲低后出现下调。

保护性和有害性GWAS基因调控的特异性SMC基因模块

通过基因共表达网络分析，研究人员在SMC中确定了24个模块。其中，模块2（M2，795个基因）在牵张条件下活性高，富含RNA加工相关基因；模块21（M21，36个基因）在胆固醇超载条件下活性高，富含Wnt信号通路基因。这两个模块的特征是促动脉粥样硬化机制，在保护性基因敲低（如LMOD1、HHIPL1）时上调，在有害基因敲低（如ALDH2、C1S）时下调。

研究结论与意义

本研究通过整合GWAS、scRNA-seq和体外功能筛选，系统地描绘了与CAD风险相关的多基因在SMC中共享的调控网络。研究发现，尽管这些靶基因编码不同的蛋白质，但它们的功能扰动汇聚于调控SMC收缩装置、细胞周期进程、NF-κB和I型干扰素信号等共同的转录程序。重要的是，基因扰动对SMC表型标记和功能读数的影响往往是独立而非协同的，挑战了体外SMC表型转换标记物可完全模拟体内复杂过程的假设。将GWAS效应方向与体外通路调控相结合，有助于区分促动脉粥样硬化机制（如胆固醇超载反应）和潜在的抗动脉粥样硬化机制（如特定牵张诱导的模块）。该研究提供了大量可公开获取的转录组数据集，为后续研究SMC在CAD中的机制提供了宝贵资源，并证明了结合遗传效应方向进行功能筛选的策略，可用于在其他细胞类型中优先考虑动脉粥样硬化的治疗靶点。