免疫微环境中液液相分离相关基因在局灶节段性肾小球硬化与微小病变疾病中的诊断价值

《Renal Failure》：Liquid-liquid phase separation-related genes in the immune microenvironment and diagnosis of focal segmental glomerulosclerosis and minimal change disease

本综述首次通过生物信息学分析揭示了液液相分离（LLPS）相关基因在局灶节段性肾小球硬化（FSGS）和微小病变病（MCD）中的关键作用。研究鉴定出PDS5A等新型诊断标志物，并深入探讨了其在免疫微环境调控中的潜在机制，为这两种肾小球疾病的精准诊断和靶向治疗提供了新视角。

　　

引言

局灶节段性肾小球硬化（FSGS）和微小病变病（MCD）是导致原发性肾病综合征的主要原因，其病理诊断依赖于组织形态学。FSGS的特征是肾小球硬化、肾小管萎缩以及受累肾段的间质纤维化，而MCD在电子显微镜下表现为足突广泛融合，光学显微镜和免疫荧光检测无明显异常。尽管确切发病机制尚不清楚，但研究表明免疫系统失调起着重要作用。这两种疾病的进展可导致终末期肾病（ESRD），造成巨大的经济负担。因此，寻找非侵入性生物标志物并阐明FSGS和MCD之间的内在联系，对于指导这两种疾病的诊断和治疗至关重要。

液液相分离（LLPS）是一种基本的生物物理现象，指的是两种不混溶液体的分离。LLPS被认为有助于细胞中无膜凝聚物的形成。过去十年的研究揭示了LLPS在机体生理和病理过程中的重要性。一方面，LLPS参与多种生理功能，如免疫反应、转录调控、信号转导、能量代谢和细胞应激调控。另一方面，异常的LLPS与多种疾病有关，其中神经退行性疾病是研究最广泛的疾病，这可能与错误折叠蛋白和受损细胞器的异常包涵体有关。此外，最近的研究揭示了LLPS在几种代谢疾病中的作用，包括2型糖尿病（T2DM）。研究发现，相分离在调节免疫信号通路中发挥作用，包括先天性和适应性免疫反应。然而，LLPS相关基因在FSGS和MCD（均为免疫介导的疾病）发生发展中的分子机制仍不清楚。

本研究首次结合LLPS与MCD和FSGS进行生物信息学分析，以探讨LLPS在MCD和FSGS中的作用。通过机器学习识别了疾病过程中LLPS相关基因的生物标志物，并进行了功能富集分析，以研究这些生物标志物可能参与的免疫机制。

方法

数据收集

本研究从基因表达综合（GEO）数据库获取了来自FSGS和MCD患者肾小球组织的微阵列数据集（GSE108109和GSE200828）。数据集GSE108109包含111个样本，包括16个MCD样本、30个FSGS样本和6个健康样本。数据集GSE200828包含153个样本，包括19个MCD样本、31个FSGS样本和6个健康样本。将GSE108109作为训练集，GSE200828作为验证集。从PhaSepDB网站下载了507个LLPS相关基因。

使用“Limma”软件包分析差异表达基因（DEGs）。根据|log₂FC（折叠变化）| ≥ 0.5且调整后P值 < 0.05的标准筛选DEGs。使用“ggplot2”包生成DEGs的火山图，使用“VennDiagram”包绘制维恩图，以识别FSGS和MCD中重叠的LLPS相关DEGs用于进一步分析。

RF-RFE/SVM-RFE

采用随机森林-递归特征消除（RF-RFE）和支持向量机-递归特征消除（SVM-RFE）算法从FSGS和MCD的交集中识别与LLPS相关的候选诊断基因。RF算法是一种基于决策树的机器学习方法，通过评估每个变量的重要性来评分变量的重要性。SVM-RFE算法是一种监督机器学习技术，通过丢弃SVM生成的特征向量来识别最优核心基因。使用相应的R包进行分析，并绘制两种机器学习方法的维恩图。

功能富集分析

使用David数据库进行基因本体（GO）（包括生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞成分（CC））和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，并使用“ggplot2”包可视化结果。P < 0.05表示具有统计学意义。

构建列线图模型

构建列线图以评估候选基因预测FSGS和MCD风险的功效。此外，使用“ComplexHeatmap”包绘制基因表达热图。

然后进行受试者工作特征（ROC）曲线分析，以分类候选基因诊断FSGS和MCD的敏感性和特异性。使用“pROC”包计算曲线下面积（AUC）。

免疫浸润分析

为了确定免疫细胞浸润并研究疾病组和对照组中的免疫微环境，使用CIBERSORT方法评估FSGS组与正常组之间以及MCD组与正常组之间22种免疫细胞浸润的差异，置换次数设置为1000。使用“ggpubr”和“ggplot2”包可视化分析结果。

候选基因验证

为验证候选基因的预测价值，使用数据集GSE200828作为验证集。使用“pROC”和“ggplot2”包进行ROC曲线分析，并应用AUC评估诊断基因的性能。

统计分析

所有统计分析均使用R 4.2.3版本完成。两组之间的比较通过Wilcoxon检验实施。所有统计检验均为双侧，P值 < 0.05表示具有统计学意义。

结果

数据集中DEGs的识别与分析

首先，我们分析了FSGS与正常组以及MCD与正常组之间的DEGs。在FSGS样本中总共发现3099个差异表达基因，在MCD样本中发现2090个差异表达基因。同时，我们下载了507个LLPS相关基因。在这些基因中，与正常组相比，FSGS有59个LLPS相关的DEGs，MCD有40个LLPS相关的DEGs。FSGS和MCD之间存在35个LLPS相关的重叠基因。

候选基因的识别

然后，通过RF-RFE和SVM-RFE算法识别候选基因。对于FSGS，RF算法获得25个特征基因。前五个重要基因是PDS5A、WBP4、FAM50A、SNRPA1和IWS1。此外，基于SVM分类模型中最高准确度，使用SVM-RFE方法筛选出3个基因。最终，通过重叠两种机器学习方法的结果，获得两个候选基因（PDS5A和EXOSC2）。

对于MCD，RF算法识别出11个特征基因。前五个重要基因是FAM50A、PRPF40A、PDS5A、RPRD1B和PDCD4。此外，基于SVM分类模型中最高准确度，使用SVM-RFE方法筛选出5个基因。最终，通过重叠两种机器学习方法的结果，获得三个候选基因（PDS5A、KHDRBS1和JUND）。

功能富集分析

为了探索与DEGs相关的分子特征和生物学功能，进行了GO和KEGG富集分析。

对于FSGS，结果显示LLPS相关的DEGs高度富集于生物过程，如RNA聚合酶II启动子转录的正调控、RNA剪接和mRNA加工。基因高度富集于细胞成分，包括核质、细胞核和核斑。此外，DEGs表现出分子功能，如蛋白结合、RNA结合和DNA结合。KEGG富集分析表明，DEGs主要富集于剪接体、mRNA监视通路和DNA复制。

对于MCD，LLPS相关的DEGs高度富集于生物过程，如RNA剪接、mRNA加工和通过剪接体进行的mRNA剪接。基因高度富集于细胞成分，主要包括核质、细胞核和核斑。此外，DEGs表现出分子功能，如蛋白结合、RNA结合和DNA结合。根据KEGG富集分析，DEGs主要富集于剪接体、细胞周期和基础转录因子。

列线图的构建与评估

为了评估候选基因的诊断价值，构建了列线图。结果显示，PDS5A和EXOSC2在预测FSGS风险方面表现出良好的性能。此外，PDS5A在FSGS中的表达较高，而EXOSC2在FSGS中的表达低于非FSGS。同时，PDS5A、KHDRBS1和JUND在预测MCD风险方面表现出良好的性能。PDS5A和KHDRBS1在MCD中的表达较高，而JUND在MCD中的表达低于非MCD。

免疫浸润分析

为了更好地阐明FSGS和MCD的免疫微环境，我们进行了免疫细胞浸润分析。条形图显示了FSGS组和对照组中22种免疫细胞的比例。结果表明，FSGS患者的幼稚B细胞水平较高，而活化的NK细胞和活化的树突状细胞水平较低。相比之下，MCD患者的M2巨噬细胞和静息肥大细胞水平较高，而γδ T细胞水平低于对照组。

ROC曲线分析

为了确定候选基因的诊断性能，分别对FSGS和MCD进行了ROC曲线分析。获得了AUC值，AUC越高表明诊断能力越强。对于FSGS，PDS5A的AUC值为0.994（95% CI: 0.979-1），EXOSC2的AUC值为0.806（95% CI: 0.564-1）。对于MCD，PDS5A、KHDRBS1和JUND的AUC值分别为1（95% CI: 1-1）、0.896（95% CI: 0.725-1）和0.958（95% CI: 0.869-1）。

此外，采用GSE200828验证候选基因的诊断能力。对于FSGS，PDS5A的AUC值为0.995（95% CI: 0.98-1），EXOSC2的AUC值为0.833（95% CI: 0.606-1）。对于MCD，PDS5A、KHDRBS1和JUND的AUC值分别为0.965（95% CI: 0.893-1）、0.877（95% CI: 0.683-1）和0.965（95% CI: 0.889-1）。总体而言，候选基因对FSGS和MDC具有优异的诊断能力。

讨论

FSGS和MCD是世界范围内导致ESRD的两种常见疾病。因此，更好地了解其潜在机制对于制定诊断和治疗FSGS和MCD的新策略至关重要。新出现的证据强调了LLPS在肾脏病理生理学中的关键作用。例如，FOXK1通过核LLPS驱动肾小管中的糖酵解爆发，加速纤维化。CDYL通过调节组蛋白巴豆酰化的相分离表观遗传凝聚物抑制常染色体显性多囊肾病中的囊肿进展。MAGI2在裂孔隔膜组装过程中通过膜相关LLPS维持肾小球滤过屏障的完整性。LLPS已在NPHS1-NCK1-N-WASP蛋白复合物中得到广泛研究，该复合物对于足细胞生物学以及FSGS和MCD中的损伤至关重要。NPHS1（编码nephrin）的突变也被已知会导致FSGS和肾病综合征。我们的研究旨在探索在FSGS和MCD发病机制中发挥作用的新LLPS相关基因。在本研究中，获得了2个FSGS候选基因（PDS5A和EXOSC2）和3个MCD候选基因（PDS5A、KHDRBS1和JUND）。PDS5A是与FSGS和MCD相关的共享基因。根据功能和通路富集分析，FSGS组中的DEGs主要富集于RNA聚合酶II启动子转录的正调控、核质、蛋白结合和RNA结合以及剪接体；MCD组中的DEGs主要富集于RNA剪接、核质、蛋白结合和RNA结合以及剪接体。免疫分析显示，FSGS患者的幼稚B细胞水平较高，活化的NK细胞和活化的树突状细胞水平较低。相比之下，MCD患者的M2巨噬细胞和静息肥大细胞水平较高，γδ T细胞水平较低。

我们的研究强调了生物信息学在诊断肾小球疾病中的关键作用。将计算方法应用于分析患者转录组数据对于识别PDS5A作为潜在诊断生物标志物至关重要。这种方法允许对数千个基因进行高通量、无偏见的筛选，并揭示在传统的、假设驱动的研究中可能被忽略的细微但具有病理意义的表达模式。此外，生物信息学允许整合多层数据，例如基因表达和免疫浸润，提供更全面的疾病景观视图。最终，将这些生物信息学发现转化为临床实践将推进肾脏病患者的个性化医疗。

PDS5A是一种姐妹染色单体早熟分离蛋白5A，是一种从酵母到人类都保守的粘连蛋白关联蛋白。PDS5A作为粘连蛋白复合物的调节剂，对许多细胞过程至关重要，如姐妹染色单体内聚、DNA损伤修复、基因转录以及DNA复制。PDS5B是PDS5A的一个重要旁系同源物，它们在调节粘连蛋白功能中扮演冗余和独特的角色。许多疾病与PDS5A有关，例如Cornelia De Lange综合征和Roberts综合征。此外，PDS5A可能对癌症的发生和发展至关重要，包括急性髓系白血病和脑癌。在人类神经胶质瘤中，PDS5A显著过表达，并且这种过表达与肿瘤分级呈正相关。正如在基因敲除小鼠模型中证明的那样，PDS5A缺陷小鼠也表现出单侧或双侧肾脏发育异常，导致围产期死亡。一项研究表明，在Cos-1猴肾细胞中过表达PDS5A会导致G1期细胞积累并增加细胞死亡。PDS5A如何影响FSGS和MCD的发展和进展尚未得到研究。

EXOSC2是FSGS的另一个候选基因。它是一种非催化性RNA外切体复合物组分，具有3′->5′核糖核酸外切酶活性。此外，它参与多种细胞RNA加工和降解事件。与EXOSC2相关的疾病包括身材矮小、听力损失、视网膜色素变性和特殊面容综合征。此外，KHDRBS1和JUND是MCD的另外两个候选基因。KHDRBS1是一种具有多种功能的编码蛋白，可能参与多种细胞过程，如选择性剪接、细胞周期调控、RNA 3′末端形成、肿瘤发生以及人类免疫缺陷病毒基因表达的调控。JUND是一种功能性激活蛋白1（AP1）转录因子复合物组分。据认为，这种蛋白质保护细胞免受p53依赖性衰老和凋亡。下调JUND可以抑制T细胞增殖。这些基因在FSGS和MCD发展和进展中的机制仍然未知，细胞周期可能受到影响，导致免疫细胞异常，从而引发疾病。

我们研究中的免疫分析表明，FSGS患者的幼稚B细胞水平较高，活化的NK细胞和活化的树突状细胞水平较低。研究表明，增加幼稚B细胞库的广度可能会影响机体的免疫反应。NK细胞是先天免疫的强大效应器，可以增强抗体和T细胞反应的能力。它们通过杀死循环肿瘤细胞的能力在预防癌症转移中发挥重要作用。研究还表明，NK细胞在肾脏疾病中发挥重要作用。同样，树突状细胞作为先天免疫防线的重要成员，与T细胞合作在肾小球肾炎中发挥重要作用。我们的结果表明，NK细胞和树突状细胞可能在FSGS的发展中发挥作用。相比之下，MCD患者的M2巨噬细胞和静息肥大细胞水平较高，γδ T细胞水平较低。研究发现巨噬细胞在肾损伤、炎症和纤维化中发挥重要作用，M2巨噬细胞的持续浸润触发成纤维细胞的活化，导致不可逆的纤维化和肾组织破坏。肥大细胞被认为在肾脏疾病的发展中发挥重要作用。巨噬细胞和肥大细胞在MCD中的作用尚未阐明。根据我们的结果，MCD组中M2巨噬细胞和静息肥大细胞的水平显著高于健康组，可能表明巨噬细胞的极化和肥大细胞的募集可能是MCD发展的重要因素。PDS5A是粘连蛋白复合物的关键调节因子，在细胞增殖和分化中具有普遍作用。所有增殖细胞，包括免疫细胞，都依赖粘连蛋白来确保准确的染色体分离并维持基因组稳定性。免疫细胞的活化、克隆扩增和分化，如生发中心的B细胞增殖，严重依赖于细胞分裂。因此，粘连蛋白复合物（包括PDS5A）对这些过程至关重要。此外，粘连蛋白通过组织3D基因组来调节基因表达，这对于免疫细胞的特化和功能很重要，例如在抗体类别转换重组和T细胞受体基因重排期间。研究强调了PDS5A-WAPL轴在调节B细胞发育中的基本性质。在NK细胞活化过程中，许多关键基因的表达可能依赖于PDS5A-粘连蛋白介导的染色质环化。研究揭示了粘连蛋白在促进T细胞受体基因重排和胸腺细胞发育中的关键作用，这一过程与基因组结构的调节内在相关。免疫浸润分析和富集分析表明，PDS5A可能影响DNA复制、RNA剪接和结合以及蛋白结合，从而影响免疫细胞的正常成熟和分化（B细胞成熟、NK细胞活化、T细胞、肥大细胞），进而导致免疫紊乱，引发疾病的发生和进展，提示PDS5A可能对寻找针对FSGS/MCD的新免疫疗法具有潜在价值。

需要注意的是，我们的研究存在一定的局限性。首先，公共数据集的样本量是固定的。我们研究中使用的实验集GSE108109和验证集GSE200828包括35个MCD样本、61个FSGS样本和12个正常样本。尽管总样本量超过100个，但这个队列仍然不足以全面衡量疾病的转录特征。训练和验证队列的样本量适中可能会影响统计功效，存在过拟合的潜在风险。未来需要涵盖不同种族群体的更大样本进行研究。其次，理想的生物标志物应该易于通过非侵入性样本（如尿液或血液）检测。虽然我们的研究确定PDS5A作为FSGS和MCD的有前景的诊断生物标志物，但这些基于组织的发现在潜在转化为常规实践之前，需要在临床可获取的体液中得到验证。第三，尽管证明了PDS5A对FSGS和MCD的诊断潜力，但需要进一步的实验研究来评估所识别基因的功能作用。将PDS5A-LLPS失调与足细胞损伤联系起来的精确分子机制尚未经过实验验证。具有标准化表型分析和机制研究的前瞻性多民族队列对于解决这些差距至关重要。

结论

本研究揭示了由PDS5A介导的失调的LLPS是FSGS和MCD中常见的致病驱动因素。我们提出PDS5A可能作为这些肾小球病的诊断生物标志物。靶向异常的PDS5A相关的相分离可能为阻止足细胞损伤提供新的治疗机会。