苔草属植物新老种群对比：苏格兰新定植与挪威长期建群Carex salina的遗传结构、繁殖方式与克隆特征研究

《Plant Ecology & Diversity》：Contrasting genetic structure, mode of reproduction and clonal characteristics in established and newly colonised populations of Carex salina Wahlenb. (Cyperaceae)

本文通过SSR分子标记对比分析了苏格兰新定植与挪威长期建群的盐沼苔草（Carex salina）及其近缘种C. recta的种群遗传结构，揭示了殖民时间、纬度及繁殖策略（有性/克隆）对遗传多样性（HO/HS）、克隆指数（R）、近交系数（FIS）及空间构型的深刻影响，为植物殖民进化与适应性演化提供了关键案例。

　　

引言

植物物种在新区域的殖民具有重大的进化潜力。以二倍体Senecio squalidus L.引入英国后的进化事件为例，分子工具的应用揭示了杂交、基因渗入乃至多倍体物种形成等多种进化过程。然而，文献中明显缺乏对物种殖民初期遗传变化的研究，这主要是因为在进化时间尺度上发现处于此阶段的物种极为罕见。

无论是通过自然长距离传播（LDD）还是人为因素，对新区域的殖民引发了一系列问题：新种群的来源、殖民的性质（通过种子还是营养体材料）、以及这是频繁发生还是罕见事件。具有混合繁殖方式的物种，与已建立的祖先种群相比，可能会经历有性和营养繁殖之间平衡的转变。另一个方面是克隆生长的空间结构也可能发生变化。这些反应并非完全可塑的，而是受到系统发育约束的限制。

种群遗传结构相对于种群寿命和LDD的影响研究相对较少，尽管种群动态可能受到种群建立所需时间的强烈影响。种群寿命也可能改变利用混合繁殖方式的物种在有性和无性繁殖之间的平衡。除了种群年龄，影响有性繁殖和克隆生长之间平衡的主要因素还包括种内和种间竞争、植物大小和资源可用性。无性繁殖提供了优势，例如增加种群增长率、成功基因型的传播，并且与有性繁殖相比能量成本更低，这些都是在殖民事件中的重要优势。殖民物种也可能面临更少的竞争，从而在新的栖息地中有更多的潜在生态位空间可供利用。

植物可能通过改变克隆生长模式来响应新的栖息地条件，导致分株的不同空间结构。克隆结构的两个极端是方阵型（phalanx）和游击型（guerilla）。方阵型表现为分株紧密聚集，没有相互交错；而游击型克隆结构具有更长的克隆生长节间，导致分株相互交错。因此，新的殖民事件为比较殖民物种在新老种群内部和之间的种群遗传结构提供了机会。

Carex salina Wahlenb.（盐沼苔草）最近在不列颠群岛的殖民和有限扩散为了解殖民物种的种群遗传学问题提供了一个机会，从而填补了文献中的一个重要空白。C. salina是一种稳定的杂交苔草，发现于加拿大东部、北欧和俄罗斯北部的咸水或半咸水海岸线。其亲本物种C. paleacea和C. subspathacea也占据沿海盐沼或潮间带栖息地，并分布在类似的范围。这两个物种均不在英国发现。

C. salina于2004年7月首次在苏格兰西海岸的Morvich被发现，此后在另外四个苏格兰盐沼中被发现。距离苏格兰最近的种群在挪威，在那里它是盐沼的常见物种。它早在1767年就有挪威植物区系记录。挪威被认为是苏格兰种群的来源地，尽管这从未经过实验证实。在挪威，C. salina与两个亲本物种同域分布。

由于最近的殖民，据推测苏格兰的C. salina具有更高水平的无性繁殖，并且与挪威种群相比基因型变异更低。该物种向南的纬度扩散提供了影响有性和克隆繁殖之间平衡的另一个因素。盐沼受到多种环境压力。这些压力可能随着纬度增加而增加，即更低的温度、冬季日照减少。此外，种群受到的季节性变化不那么极端，导致随着纬度降低压力减少。

挪威和苏格兰C. salina种群之间遗传结构的潜在差异可能源于殖民效应或由纬度变化引起的转变。密切相关的C. recta Boott.在苏格兰河口栖息地长期存在，使我们能够将与殖民时间相关的差异和与纬度相关的差异分离开来。

本研究（1）描述了新近建立的苏格兰C. salina种群的种群遗传变异、有性和营养繁殖之间的平衡以及克隆空间模式；（2）将这种变异模式与长期建立的挪威C. salina种群的变异模式进行了比较；（3）将苏格兰C. salina的变异模式和克隆组成与苏格兰C. recta进行了比较，以解释纬度和种群年龄对殖民物种的潜在影响。

预计挪威的C. salina将呈现最高水平的遗传变异，这是由于与苏格兰种群相比，有更多的机会进行花粉交换、种群寿命更长以及靠近其他种群。由于奠基者效应和漂变，预计苏格兰C. salina的遗传变异将是最低的。预计苏格兰的C. salina种群将比建立时间长得多的C. recta和挪威C. salina种群呈现更高水平的克隆性，因为LDD很罕见；因此，种群增长预计是克隆性的而不是有性的，尽管与挪威相比，苏格兰纬度降低的非生物选择压力可能会在一定程度上抵消这一点。

苏格兰的新种群可能显示出更大的克隆规模和方阵状的空间生长，因为少数基因型可能使该物种能够开发新的栖息地。相反，挪威的种群可能显示出更大的规模和重叠，具有游击状的模式，因为它们有更长的时间来开发其资源。

材料与方法

研究物种

苔草属（Carex）是一个物种丰富且进化活跃的属，物种形成通过核型分裂、融合和易位发生，同时伴随着频繁的杂交。这种高杂交率很大程度上归因于该属中发现的全着丝粒染色体，尽管在该属各个组中杂交频率存在显著差异。C. salina是苔草属Phacocystis组的成员，该组中杂交非常常见。有人认为这是该组许多物种所占据的河口和沼泽栖息地的产物。除了C. salina，Phacocystis组在英国还有另外七个物种代表。这些物种占据从盐沼、河口、沼泽到山地栖息地的一系列环境。

C. salina具有跨大西洋分布，原产于俄罗斯、北美和斯堪的纳维亚半岛。它既进行克隆繁殖也进行有性繁殖。C. salina是一个同倍体杂交种（2n = 77–79），是Carex paleacea Schreb. Ex Wahlenb.（2n = 72,73）和Carex subspathacea Wormsk.（2n = 78–83）杂交的产物。这两个亲本物种主要通过根茎进行无性繁殖。

Carex recta（河口苔草）也是苔草属Phacocystis组内的一个同倍体杂交种（2n = 72）。它与C. salina共享一个亲本Carex paleacea，第二个亲本是Carex aquatilis Wahlenb.（2n = 74）。后一种 riparian 物种在英国也有记录。苏格兰的C. recta种群在苏格兰建立的时间比C. salina长得多，最早于1885年在Wick由Grant和Ridley记录。它仍然在这个地点和另外两个苏格兰东部河口被发现。

采样

C. salina在2018年至2022年间采样，从苏格兰高地的五个种群（Morvich, Strontian, Loch Sunart, Loch Long, 和 Loch Nevis）、挪威Troms?的六个种群（V?gnes, Sandvika, Nordbotn, Kvalsundet, Finnvika 和 G?rdelvneset）、Bod?的两个种群（Morsvikbotn 和 Ullsvag）以及Molde的两个种群（Staurnesv?gen 和 Malme）共收集了354份样本，总计15个种群。叶片样本在每个地点代表性采样，采样植物之间最小距离约为5米。这个距离有时会根据种群大小和布局进行调整，以确保对整个地点具有代表性。样本保存在硅胶中。每个个体和种群的GPS坐标也被记录。

使用先前由作者之一（PA）在2018年收集的植物材料以及E. Dumbill（ED）在2012年收集的材料来评估遗传变异的时间变化。苏格兰和Troms?的地点是根据已确认的C. salina种群的存在而选择的。其他挪威地点是通过探索可能的栖息地来确定的。

对于C. recta，分析了分布在苏格兰高地的六个种群的总共165个样本。样本从六个种群收集：Beauly, Altass, Carbisdale, Bonar Bridge East, Bonar Bridge West, 和 Wick，分别于2008年和2011年由M. Dean（MD）收集，以及2020年由作者JCB和MA收集。考虑到种群的空间布局，对种群进行了调查，随机采样单个分株，最小间隔5米。叶片样本收集并保存在硅胶中。2020年记录的每个样本的GPS位置被记录。

DNA提取与扩增

使用高盐CTAB法提取DNA。对于C. salina，进行多重和单重PCR扩增。使用ABI 3500遗传分析仪进行片段分析。使用Geneious自动调用结果数据，并手动评分以检查阶梯、峰和等位基因分档错误。

对于C. recta，热循环仪条件（除T_a外）如所述。每个多重退火时间可在补充信息中找到。片段分析和随后的原始数据分析如前所述对C. salina进行。

数据分析

在分析之前，使用MicroChecker 2.2.3分析位点，未观察到stuttering或大等位基因丢失。某些位点观察到纯合性增加，但这可能是苔草属物种高自交率的结果。数据分析主要使用RStudio中的MLGsim 2.0。使用R包‘poppr’构建基因型积累曲线以评估标记分辨率。使用PopGenUtils包计算身份概率（PID）和全同胞间身份概率（PIDsib）来评估微卫星标记组的辨别能力。

使用R包RClone计算P_SEX以评估给定多基因座基因型（MLG）频率在随机交配种群中出现的概率。将P_SEX > 0.05的个体重新分配为无性系内的非克隆个体。然后计算遗传多样性指标：使用MLGsim 2.0估计观测杂合度（H_O）、平均种群内基因多样性（H_E）和近交系数（F_IS）。使用poppr估计每个种群的克隆指数（R）和基因型多样性（P_d）。最后，使用R包hierfstat计算每个种群的额外遗传参数（H_O, H_S, F_IS）。还使用‘poppr’包计算了关联指数（Ia）、均匀度和私有等位基因的额外估计值，并使用‘hierfstat’计算了每个位点的平均等位基因丰富度。

使用R包‘hierfstat’计算重复年份采样的种群之间的配对F_ST，以确定其随时间的变化。使用包‘cloncase’模拟随时间推移的种群中有性繁殖率。使用‘poppr’包进行分子方差分析（AMOVA），使用9999次排列来测试苏格兰C. salina和C. recta数据集中年份之间以及种群内部和之间的遗传变异。使用‘poppr’基于Bruvo等人的距离构建最小生成网络（MSN），仅限于有时间采样的种群，以可视化跨年份的多基因座基因型（MLG）关系。

使用‘poppr’进行判别主成分分析（DAPC）以识别遗传簇，从而描述遗传变异和克隆结构的模式。使用包‘hierfstat’和‘pegas’计算种群间的配对F_ST值，以推断遗传分化和距离隔离，并使用ggplot2进行这些配对值的热图可视化。使用‘geosphere’包中的‘distm’函数通过Haversine公式计算采样位置之间的地理距离。使用Spearman等级相关性（或在适当情况下使用Pearson积矩相关）进行Mantel检验，并进行9999次排列，以评估遗传距离和地理距离之间的关系，从而检验距离隔离。分析分别对所有C. salina种群组合、苏格兰C. salina子集、挪威C. salina子集和苏格兰的C. recta种群进行。

使用R包‘adegenet’构建稀疏主成分分析（sPCA）。该分析基于单链接方法K最近邻，其中一般连通性通过距离衰减或邻居计数的影响来强调。使用肘部法确定最佳K，两个物种均为K=3。保留了三个正轴和零个负轴。使用9999次排列的蒙特卡洛检验来检验sPCA中是否存在显著的空间结构。

使用包‘RClone’计算最近单元对之间克隆同一性概率的比较，使用聚合指数（排列=9999），用于检验克隆个体在种群内是空间聚集还是随机分布，从而可以比较不同种群的克隆空间模式。使用‘poppr’包和自定义函数构建基于独特和克隆多基因座谱系（MLL）的克隆图谱。由于缺乏地理参考，排除了ED在2012年收集的C. salina样本和MD在2008年和2011年收集的C. recta样本。

为了研究苏格兰的C. salina克隆基因是否比挪威的大，使用Mann-Whitney U检验比较了最大成对分株距离（米）和每个基因的分株数量。然后使用包‘geosphere’和‘ggplot2’计算和绘制最大克隆长度，即克隆组最远两点之间的最大距离（米）。

结果

基因型积累曲线显示MLG数量随着额外位点的增加而明显增加。C. recta的MLG检测增加比C. salina数据集更渐进，但两者在达到最大位点数之前都达到了>90%的总MLG，支持所选标记的充分性，并且观察到的克隆水平不太可能是标记分辨率不足的假象，反映了真实的生物结构。为评估C. salina和C. recta微卫星标记组分辨率而计算的累积PID值远低于0.01，累积PID_sib值低于0.05，表明即使在密切相关的保守假设下，区分个体的能力也很强。

苏格兰C. salina种群显示出最低的克隆水平（P_D = 0.596; R = 0.593），而挪威种群的克隆程度超过一倍（P_D = 0.246; R = 0.241）；C. recta的值处于中间（P_D = 0.345; R = 0.341）。基因型丰富度在苏格兰C. salina中最高（G = 109, n = 183），其次是C. recta（G = 57, n = 165），在挪威最低（G = 42, n = 171）。苏格兰C. salina种群的基因型均匀度（0.449）也高于C. recta（0.567）和挪威（0.294），表明苏格兰的基因型分布更均匀。

等位基因丰富度在物种和地点之间相似（苏格兰=2.13；挪威=1.98；C. recta=1.85），尽管苏格兰C. salina拥有更多的私有等位基因（PA=13）比挪威C. salina（PA=9）或C. recta（PA=9）。在所有类群中，观测杂合度都超过了期望值，在挪威最为显著（H_O = 0.714; H_S = 0.410; F_IS = -0.741），其次是C. recta（H_O = 0.525; H_S = 0.348; F_IS = -0.506），在苏格兰程度较轻（H_O = 0.485; H_S = 0.406; F_IS = -0.186）。以关联指数（Ia）衡量的连锁不平衡在挪威最大（Ia = 2.335），在C. recta中中等（Ia = 3.571），在苏格兰最低（Ia = 0.459），反映了挪威种群更强的克隆信号。

苏格兰C. salina种群的时间采样揭示了基因型多样性和克隆性随时间的适度变化。在Strontian，克隆丰富度（R）从2012年的0.524增加到2019年的0.737，同时观测杂合度增加（H_O = 0.545 到 0.750），F_IS从正值（0.344）转变为负值（-0.128），表明异交增加。Loch Sunart显示出类似的趋势，R从2012年的0.316增加到2019年的0.727，F_IS从-0.449变为-0.043。Morvich表现出更大的波动，R在2012年和2018年之间下降（0.5 到 0.353），然后在2019年上升到0.9；F_IS从-0.659到0.208的相应变化表明可能发生了有性繁殖招募事件。

在C. recta中，时间变化在不同地点不太一致。在Wick，尽管等位基因丰富度稳定且F_IS降低（-0.963 到 -0.360），但R从2011年的0.455下降到2020年的0.222，表明在保留杂合度的同时克隆扩张。Bonar Bridge East显示R增加（0.421 到 0.500），而Beauly显示R随年份显著下降（2008年为0.778，2011年为0.333，然后2020年再次为0.333），并持续高杂合度。

时间重复的Cloncase建模显示两个物种都具有中到高的自交率（s），范围从C. salina的0.55到1.00，以及C. recta的0到0.61。值得注意的是，C. salina种群持续返回高自交估计值（例如STR s = 0.77–0.90；LSU s = 1），支持其主要是自交的繁殖策略。相比之下，C. recta种群在自交率上表现出更大的变异性，包括未检测到自交的情况（RBE 2008–2011 s = 0），表明混合的繁殖模式。有效种群大小（Ne）的估计值变化很大，大多数值在20到340之间，有一个明显的异常值（RBW 2011–2020 Ne = 1249）。MOR 2018年与2019年的比较产生了不现实的高Ne估计值（>10¹¹），可能是由于等位基因频率变化极小和时间分辨率低。这被解释为缺乏可检测的漂变，而不是有生物学意义的种群大小。

AMOVA结果揭示了三个苔草组之间遗传结构的对比模式。关于苏格兰的C. salina种群，在种群内部发现了显著的遗传结构，而在种群之间没有。相比之下，挪威的C. salina显示出种群间显著的遗传分化，而种群内部没有分化。C. recta在种群内部和之间都显示出显著的变异。苏格兰的C. salina和C. recta在年份之间都没有显示出显著的分化。

最小生成网络分析揭示了不同的时间遗传模式。在C. salina中，有一个大的节点，包含主要来自Morvich和Loch Sunart不同年份的基因型聚集在一起，反映了长寿的克隆谱系和很少的时间分化。两个较小的节点分别代表来自Strontian和Morvich的基因型，较低的分支包含了不同的谱系，揭示了种群的一些混合。相比之下，C. recta显示每个地点的节点和分支是独特的，Wick样本由两个不同的分支组成。其中一个（右下角）显示了一个由与所有其他基因型都不同的基因型组成的分支。在同一地点的不同年份，C. recta在节点上的聚类比C. salina少。

判别主成分分析揭示了挪威和苏格兰C. salina组之间强烈的遗传分化，沿判别轴没有重叠。挪威种群聚类更紧密，表明种群相似性更高，而苏格兰种群显示出稍微更分散，表明地点内更广泛的遗传多样性。

在苏格兰内部，C. salina种群显示出重叠但可区分的分组。Morvich在很大程度上与其余种群分离，种群之间的重叠表明遗传相似性。挪威的C. salina地点与苏格兰相比表现出更明显的聚类。彼此靠近的种群，如V?gnes和Ullsvag，形成了紧密、分离良好的组，表明该地区内更广泛的遗传结构。

C. recta种群表现出显著的遗传结构。Beauly（BEA）种群在遗传上与其他种群明显不同。其他地点如Wick（WCK）和Carbisdale（CAR）分组更紧密，一些组内扩散表明遗传变异水平较低。

配对F_ST比较揭示了挪威和苏格兰的C. salina种群之间存在强烈的遗传分化（F_ST > 0.4），而区域内比较更为温和（F_ST ≈0.1 – 0.3）。种群内的时间重复通常呈现低F_ST（<0.1），与克隆持续性一致。在C. recta中，大多数种群分化较弱（F_ST < 0.2），有明显的例外可能是由于地理距离（BEA_2008 对 CAR_2020 F_ST = 0.49）。这些种群内的时间变化也很小。

sPCA也显示了苏格兰C. salina种群和挪威种群之间清晰的遗传分离。这通过显著的全局结构得到证实；没有观察到显著的局部结构。每个区域内的种群在遗传上都是相似的，然而Troms?与Bod?、Trondheim和Molde地区之间的区别是明显的。C. recta在种群间表现出较少的遗传相似性，Beauly（BEA）表现为一个孤立的种群。C. recta种群也显示出显著的全局结构，但没有显著的局部结构。

当考虑所有C. salina种群组合时，发现遗传距离和地理距离之间存在显著的正相关（Mantel r = 0.308, p = 0.003），表明在更广泛的物种水平上存在距离隔离的证据。当分别分析时，挪威的C. salina种群表现出强烈且显著的距离隔离模式（Mantel r = 0.645, p = 0.001）。相反，在苏格兰的C. salina种群内部没有观察到显著的关系（Mantel r = 0.280, p = 0.192）。对于Carex recta，没有检测到遗传距离和地理距离之间的相关性（Mantel r = -0.038, p = 0.579），揭示了采样地点之间缺乏距离隔离。

苏格兰和挪威C. salina种群之间的最大克隆传播没有显著差异（W = 123, p = 0.650），每个基因的分株数量也没有显著差异（W = 139.5, p = 0.928）。同样，C. salina和C. recta在最大克隆传播（W = 152, p = 0.363）或每个基因的分株数量（W = 167.5, p = 0.129）方面也没有发现显著差异。尽管苏格兰的C. salina种群具有较高的中位克隆传播（67.1米），但其较低的聚合指数（Ac = 0.031）表明克隆基因之间重叠最小。

相比之下，挪威的C. salina种群显示出较低的中位克隆传播（47.9米），但聚合度更高（平均Ac = 0.240），表明基因的空间聚类更密集。C. recta在所有种群中显示出最高的中位克隆传播（303米），并且聚合值（平均Ac = 0.215）与挪威的C. salina相似。这些空间聚类模式得到了聚合指数的支持，并通过克隆基因的空间映射进行了可视化。

讨论

我们预测，与新近建立的苏格兰Carex salina种群相比，长期建立的高纬度挪威C. salina种群以及在苏格兰相同纬度长期建立的近缘种C. recta种群，会表现出更低的遗传变异、克隆传播以及孤立的、方阵型克隆。然而，我们发现苏格兰新的C. salina种群遗传多样，进行有性和克隆繁殖，并具有游击型空间结构的克隆。这些模式与挪威的C. salina和C. recta形成对比。

两个物种都呈现混合繁殖模式，观察到有性和克隆繁殖，尽管相对比例因物种、地点和年份而异。两个物种中存在有性繁殖是值得注意的，因为两者都被认为在很大程度上是不育的。在C. salina中，克隆性被确定为每个地点内的主要繁殖方法，而每个调查的C. recta地点都呈现克隆和独特个体，并且在六个地点中有四个地点鉴定出克隆繁殖。两个地点主要是进行有性繁殖的种群。

所有种群都显示出杂合子过剩。可能导致这种现象的几个因素包括小种群规模、克隆性和杂交起源。理解其在C. salina和C. recta中的发生需要进一步研究，尽管种群大小和克隆性在物种和地点间的变异，加上杂合子过剩的近乎普遍性，表明至少部分是由于两个物种的同倍体杂交起源。

在较年轻的苏格兰C. salina种群中观察到的遗传变异高于较老的挪威C. salina种群。这是两个地区繁殖模式差异的结果，挪威的克隆性更强。C. recta的遗传变异介于两者之间，与挪威的C. salina种群相比克隆性较少，但比苏格兰的C. salina多。苏格兰的C. salina种群在遗传上比挪威的C. salina更相似。C. recta种群是种群间分化最明显的，每个种群在遗传上都是独特的。

C. recta种群的独特性可能是积累微卫星变异的时间和隔离的产物，种群间基因流非常少。相比之下，苏格兰C. salina种群之间的相似性可能是由于地点间的高基因流或共享的祖先种群。苏格兰C. salina缺乏距离隔离表明共享的祖先种群是相似性的更可能原因。苏格兰和挪威的C. salina之间缺乏遗传一致性意味着本研究中采样的挪威种群都不是苏格兰种群的来源。确定苏格兰C. salina的来源并比较这些祖先种群的遗传结构也将是有用的。

由于靠近长期建立的种群增加了基因流的机会，预计挪威C. salina种群可能具有更高水平的遗传变异，在这项研究中并未观察到。 presumably 挪威种群位于北极圈以北， contrasting 生长条件选择了克隆繁殖而不是有性传播。先前记录显示，在一系列科中，高压力栖息地中的物种表现出更高水平的克隆繁殖，包括Amphibromus scabrivalvis（禾本科）、Iris hexagona（鸢尾科）、Geum reptans（蔷薇科）、Hedysarum laeve和Trifolium repens（均为豆科）。

当地条件，如演替阶段和栖息地大小，也可能影响了这些C. salina种群中有性和无性变异的相对程度，这一属性正在维管植物和苔藓植物中进行探索。与近期受干扰的地点相比，晚期演替fen中的苔藓植物Scorpidium cossonii和Campy