结核分枝杆菌系统发育谱系与内在药物耐受性变异的相关性研究

《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》：Variability in intrinsic drug tolerance in Mycobacterium tuberculosis corresponds with phylogenetic lineage

本文通过建立高通量实时时间杀菌测定法，揭示了结核分枝杆菌不同谱系（L1-L4）对利福平和贝达喹啉的耐受性差异，发现L3和L4谱株具有更高耐受性，且耐受性具有遗传性；研究进一步鉴定出与细胞壁代谢、脂质代谢等通路相关的基因突变显著富集于高耐受菌株，为理解耐药结核病的进化机制提供了新的表型与基因型关联证据。

　　

引言背景

结核病（Tuberculosis, TB）仍是全球单一传染病致死的主要原因，其病原体结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）因富含脂质的细胞壁和休眠能力而被认为对多种抗生素具有先天耐受性。耐多药结核病（Multidrug-resistant TB, MDR-TB）疫情常由Mtb复合体（MTBC）中人适应谱系中的L2和L4引起，但其关联机制尚未明确。药物耐受性（指细菌在杀菌浓度抗生素长期暴露下的存活能力）被认为在耐药进化中起关键作用。本研究旨在探讨MTBC不同谱系是否存在内在药物耐受性差异，并分析其遗传基础。

研究方法创新

为高效评估Mtb药物耐受性，研究团队开发了实时时间杀菌测定法（real-time time-kill assay, rt-TKA）。该方法基于细菌细胞内ATP检测（BacTiter-Glo试剂），通过测量药物作用下细菌存活率随时间的变化，计算杀灭95%种群所需的最短时间（MDK₉₅

菌株特性与药物敏感性

研究选取了102株遗传多样的药物敏感临床分离株（涵盖L1-L4谱系）。药敏试验显示，利福平最低抑菌浓度（MIC）中位数为0.05 μg/mL，贝达喹啉MIC中位数为0.5 μg/mL。谱系间比较发现，L1菌株对BDQ的敏感性显著高于L3和L4，而利福平敏感性无显著谱系差异。两名利福平耐药（MIC ≥1 μg/mL）和三株BDQ耐药（MIC >1 μg/mL）菌株被排除后续耐受性分析。

耐受性谱系特异性规律

通过rt-TKA测定95株敏感菌的耐受性，发现菌株对利福平的耐受范围（MDK₉₅为2.1-15.5天）整体高于贝达喹啉（约1.2-14天）。谱系层面，L1对利福平和贝达喹啉的耐受性均最低；L3和L4对两种药物均表现出较高耐受性（如L3对利福平的耐受性显著高于L1和L2，对贝达喹啉的耐受性显著高于L1和L2）。此外，13株菌同时表现出对利福平和贝达喹啉的高耐受性，提示存在多药耐受表型。利福平耐受性与MIC呈负相关，而贝达喹啉耐受性与MIC正相关。

遗传特征与机制探索

系统发育信号分析（Pagel’s lambda和Blomberg’s K）表明，药物耐受性和MIC在遗传相近菌株中相似，证实耐受性是可遗传性状。全基因组关联分析（GWAS）未发现达到显著性阈值的单一突变，但富集分析显示，高耐受菌株中与应激反应、毒力及细胞壁合成相关的基因突变显著富集。例如，高利福平耐受菌株中富集了与静止期上调相关的PflA（Rv3138）基因P271T突变；高贝达喹啉耐受菌株中富集的突变涉及脂质代谢（如fadD25、fadD26、ppsA）、细胞壁过程（如lppD、tig）及信息通路（如hsdM）等。许多突变为L3特有，但tig L118P、lppD P123L和fadD26 V240M等突变在多个谱系中出现。

讨论与展望

本研究否定了初始假设中L2和L4具有更高耐受性的预期，却发现L3和L4普遍具有高耐受性。这种跨不同药物机制的耐受性提示其可能由谱系进化塑造的固有特征驱动，而非近期药物适应结果。rt-TKA方法的建立为大规模耐受性研究提供了实用工具，但其局限性（如未去除胞外ATP）需在后续优化中考虑。鉴定出的突变基因多与细胞壁完整性、代谢调节和持久性相关，表明这些通路在耐受性中的核心作用。未来需结合流行病学数据进一步明确耐受性对临床耐药发展的贡献。

总结

本研究系统揭示了结核分枝杆菌药物耐受性的谱系依赖性规律，建立了高效表征方法，并初步探索了其遗传基础，为理解耐药结核病的进化动力学提供了重要依据。