铜绿假单胞菌对头孢地尔/泽鲁波巴坦的敏感性：突变耐药机制与获得性β-内酰胺酶的作用研究

《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》：Contribution of mutational resistance mechanisms and acquired β-lactamases to cefiderocol/xeruborbactam susceptibility in Pseudomonas aeruginosa

本综述系统评估了新型β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂组合——头孢地尔/泽鲁波巴坦（Cefiderocol/Xeruborbactam）对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的体外活性。研究通过构建涵盖关键染色体耐药机制（如ampC过表达、外排泵上调、孔蛋白缺失、铁摄取缺陷）的敲除突变株以及表达主要流行β-内酰胺酶（如PER-1, SHV-12, KPC Ω-loop突变体, NDM变体）的转化株，揭示了该组合对大多数耐药机制均保持活性，尤其能有效克服由获得性β-内酰胺酶介导的头孢地尔（FDC）耐药，对99株头孢地尔耐药临床菌株的敏感性恢复率达78%（MIC90从64 mg/L降至4 mg/L）。研究强调了泽鲁波巴坦（XER）作为广谱抑制剂（靶向A-D类酶）的潜力，同时也指出其增效作用在铁摄取相关基因（如piuC）缺陷突变株中受限，并探讨了铜绿假单胞菌背景（如MexAB-OprM外排泵）对抑制剂效能的影响。该研究为头孢地尔/泽鲁波巴坦的临床定位和应对日益严峻的铜绿假单胞菌耐药问题提供了重要的体外数据支持。

　　

ABSTRACT

头孢地尔/泽鲁波巴坦是一种新型的β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂组合，其中铁载体头孢菌素头孢地尔与广谱抑制剂泽鲁波巴坦配对，后者靶向A至D类β-内酰胺酶。本研究评估了铜绿假单胞菌耐药机制对头孢地尔/泽鲁波巴坦敏感性的影响。测试了一组61个铜绿假单胞菌PAO1衍生株，包括20个代表关键染色体耐药机制的敲除突变株和41个产生主要流行β-内酰胺酶的转化株。泽鲁波巴坦以4和8 mg/L的浓度与头孢地尔和头孢吡肟联用进行评估，并与坦尼波巴坦进行比较。此外，还评估了99株头孢地尔耐药的临床铜绿假单胞菌分离株。头孢地尔/泽鲁波巴坦对大多数具有染色体编码耐药机制的铜绿假单胞菌突变株保持活性。然而，铜绿假单胞菌piuC缺陷突变株导致头孢地尔最低抑菌浓度升高（MIC = 2 mg/L），且泽鲁波巴坦无法恢复其活性。泽鲁波巴坦显著增强了头孢地尔对大多数铜绿假单胞菌PAO1转化株的活性，包括那些产生PER-1、SHV-12、KPC Ω-loop突变体或NDM变体的菌株。头孢地尔/泽鲁波巴坦对IMP型MBL（仅微弱水解头孢地尔）具有活性，包括对泽鲁波巴坦耐药的酶。与坦尼波巴坦相比，基于泽鲁波巴坦的组合对铜绿假单胞菌PAO1转化株显示出相似的活性，但在测试金属β-内酰胺酶产生菌时MIC值略高。这种基于泽鲁波巴坦组合的MIC升高部分是由于铜绿假单胞菌背景中固有的MexAB-OprM外排系统所致，这一点在铜绿假单胞菌PAO1外排突变株中得到了证实。重要的是，泽鲁波巴坦使99株头孢地尔耐药的铜绿假单胞菌中78%的菌株恢复了敏感性，将MIC₉₀从64 mg/L降至4 mg/L。头孢地尔/泽鲁波巴坦显示出对抗铜绿假单胞菌的良好前景。

INTRODUCTION

铜绿假单胞菌是一种高优先级病原体，常引起危及生命的感染，尤其是在危重或免疫功能低下患者中。严重的铜绿假单胞菌感染通常与高发病率和死亡率相关，这主要是由于对包括头孢菌素和碳青霉烯类在内的广谱β-内酰胺类药物高度耐药导致治疗选择有限。铜绿假单胞菌中的β-内酰胺耐药通常由单个菌株内多种耐药机制的积累所驱动，导致所谓的“难治型”表型。这些机制通常涉及上调ampC和外排泵操纵元表达的突变，以及外膜孔蛋白OprD的破坏。近年来，通过水平获得编码β-内酰胺耐药机制基因（如超广谱β-内酰胺酶和碳青霉烯酶）使情况进一步恶化。这些酶在全球范围内传播日益广泛，特别是在流行病学高风险克隆中，如ST235，其特别容易获得赋予广谱β-内酰胺耐药性的移动遗传元件。近年来新型β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂组合的引入，如头孢洛扎/他唑巴坦、头孢他啶/阿维巴坦和亚胺培南/瑞莱巴坦，有助于部分减轻β-内酰胺耐药铜绿假单胞菌感染的临床影响。然而，这些药物对产金属β-内酰胺酶的菌株无活性，而MBL是全球铜绿假单胞菌菌株中最普遍的碳青霉烯酶。此外，对这些组合的耐药性可能通过治疗期间选择的突变事件出现，例如AmpC的结构修饰或OprD缺失与MexAB-OprM外排泵过度产生的结合。在此背景下，抗假单胞菌药物库亟待扩充。

头孢地尔是最近美国FDA批准的具有强效抗假单胞菌活性的β-内酰胺抗生素。其化学结构融合了早期头孢菌素的关键元素：R1位带有头孢他啶或头孢洛扎的羧基丙氧亚氨基基团，C3位带有头孢吡肟的吡咯烷鎓基团，这赋予其对抗β-内酰胺酶的增强稳定性并提高了与青霉素结合蛋白的亲和力。然而，头孢地尔最显著的特点是在R2位存在一个氯儿茶酚部分，使其能够螯合游离的三价铁离子，并通过铁载体介导的铁摄取途径进入周质空间。该机制使头孢地尔能够达到比常规β-内酰胺高得多的周质浓度。这些组合的结构特征导致其对多种优先革兰氏阴性病原体（包括铜绿假单胞菌）具有强大的体外活性，无论其潜在的耐药机制如何。然而，具有强效头孢菌素酶活性的获得性β-内酰胺酶（如NDM-1和PER-1）的日益流行，越来越多地与铜绿假单胞菌中的头孢地尔耐药相关。此外，使用转座子突变体库以及大量监测和实验室分离株的研究表明，铁摄取相关基因的功能丧失是驱动铜绿假单胞菌头孢地尔耐药的另一主要机制。这些耐药机制损害了头孢地尔的疗效，限制了其作为近年来最有前途的抗假单胞菌药物之一的潜力。

为了制定保护和增强头孢地尔活性的策略，这种铁载体头孢菌素最近已进入与泽鲁波巴坦联合的临床试验评估阶段，泽鲁波巴坦是一种通过战略性修饰苯并氧硼杂环辛烷支架而开发的新型广谱硼酸酯型β-内酰胺酶抑制剂。泽鲁波巴坦对A、B、C和D类β-内酰胺酶表现出强大的抑制活性，抑制浓度在纳摩尔范围内。值得注意的是，其抑制谱超过了其他最近开发的硼酸酯抑制剂，如坦尼波巴坦，因为它也靶向IMP型MBL。迄今为止，泽鲁波巴坦的活性主要在与美罗培南联合使用时进行评估，显示出对多重耐药革兰氏阴性病原体的高效力，包括对最近批准的β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂组合耐药的菌株。然而，我们最近的研究结果表明，泽鲁巴坦增强美罗培南抗铜绿假单胞菌活性的能力有限，这可能与该物种中普遍存在β-内酰胺酶非依赖性的碳青霉烯耐药机制有关。尽管如此，用头孢地尔替代美罗培南作为泽鲁波巴坦的搭档可能提供有意义的治疗优势，特别是对于治疗铜绿假单胞菌感染。然而，据我们所知，头孢地尔/泽鲁波巴坦组合克服铜绿假单胞菌中高度复杂的β-内酰胺耐药机制的能力，无论是突变性的还是通过水平基因转移获得的，尤其是那些损害头孢地尔疗效的机制，尚未得到探索。

因此，为了有助于头孢地尔/泽鲁波巴坦对抗铜绿假单胞菌的治疗定位并报告其临床开发进展，我们旨在评估该组合对抗铜绿假单胞菌主要β-内酰胺耐药机制的体外活性和稳定性，包括影响头孢地尔的那些机制，并在铜绿假单胞菌背景下比较其与其他最近开发的β-内酰胺酶抑制剂的效力。

RESULTS AND DISCUSSION

染色体编码耐药机制对铜绿假单胞菌头孢地尔/泽鲁波巴坦敏感性的影响

针对具有染色体编码β-内酰胺耐药机制的关键铜绿假单胞菌突变株测试的头孢地尔、头孢地尔/泽鲁波巴坦和其他相关抗假单胞菌对照药的最低抑菌浓度如表1所示。还显示了泽鲁波巴坦和坦尼波巴坦对这些菌株的相对抑制活性，两者均以头孢吡肟和头孢地尔作为β-内酰胺报告药。还考虑了添加泽鲁波巴坦对头孢吡肟或头孢地尔MIC的影响。头孢地尔对这组分离株表现出显著的活性，巩固了其作为目前可用的最有效的抗假单胞菌药物的地位。正如先前报道的，所有测试突变株的头孢地尔MIC均保持在野生型范围内，与亲本铜绿假单胞菌PAO1菌株相当，持续低值在0.06至0.125 mg/L之间。这些结果进一步支持了头孢地尔克服经典β-内酰胺耐药机制的能力，即使这些机制同时存在。极高的内在活性使得泽鲁波巴坦几乎没有空间进一步增强头孢地尔的活性，这体现在头孢地尔单独使用和与泽鲁波巴坦联合使用时在所有测试菌株中获得的相同MIC值。该集合中唯一导致头孢地尔及其组合耐药性有意义增加的突变株是携带piuC失活的菌株。piuC的功能丧失突变已知在头孢地尔压力下被强烈选择，如先前在体外和体内所述。在我们的piuC突变株中，头孢地尔MIC增加了16至32倍，表明剥夺铜绿假单胞菌的PiuC介导的摄取会将头孢地尔的活性降低到与常规头孢菌素相当的水平。因此，这些发现表明，在因铁摄取受损而导致头孢地尔MIC升高的菌株中，泽鲁波巴坦的增效作用将受到损害。对所有携带染色体编码耐药机制的突变株的MIC测试未显示使用坦尼波巴坦或泽鲁波巴坦作为抑制剂时头孢地尔MIC存在显著差异。

另一方面，使用头孢吡肟作为报告药使我们能够更好地分析泽鲁波巴坦对这些具有突变驱动耐药机制的菌株的增强效果，并将其效力与坦尼波巴坦进行比较。坦尼波巴坦和泽鲁波巴坦均降低了头孢吡肟对所有显示ampC过表达突变株的MIC。这增加了进一步的证据，并与其他作者关于坦尼波巴坦和泽鲁波巴坦对PDC β-内酰胺酶的有效覆盖数据一致，PDC是铜绿假单胞菌中最重要的头孢菌素耐药机制。添加4或8 mg/L的泽鲁波巴坦并未引起头孢吡肟MIC的重要变化，尽管在某些情况下，4 mg/L的浓度倾向于导致不显著的略高MIC。关于显示其他机制的菌株，观察到以下情况：MexAB-OprM、MexXY和MexCD-OprJ的过度生产在所有情况下均导致头孢吡肟MIC增加，而添加坦尼波巴坦或泽鲁波巴坦的影响可忽略不计；OprM的失活导致对所有β-内酰胺的超敏性，这是归因于MexAB-OprM天然活性的充分表征的现象；OprD缺失对非碳青霉烯类β-内酰胺的活性没有任何影响。

获得性β-内酰胺酶对铜绿假单胞菌头孢地尔/泽鲁波巴坦敏感性的影响

评估了头孢地尔/泽鲁波巴坦对一组41株产生多种临床相关β-内酰胺酶的铜绿假单胞菌PAO1实验室转化株的活性。还评估了泽鲁波巴坦和坦尼波巴坦与头孢吡肟和头孢地尔联合使用的相对抑制效力。与具有突变机制的等基因分离株相比，一些β-内酰胺酶导致头孢吡肟和头孢地尔的MIC大幅增加，这使我们能够精确确定泽鲁波巴坦的效力和β-内酰胺酶覆盖谱。头孢地尔/泽鲁波巴坦组合对我们模型中包含的41个转化株中的36个具有活性，在13株头孢地尔耐药分离株中的7株中恢复了头孢地尔敏感性，并且在大多数情况下将头孢地尔MIC降低至野生型值。

关于A类酶，头孢地尔单独对许多产生已知微弱灭活该抗生素的β-内酰胺酶变体的转化株保持活性。然而，在产生SHV-12、PER-1、VEB-1、VEB-25以及KPC Ω-loop变体KPC-31和KPC-35的转化株中，MIC增加至高于EUCAST临床折点水平，所有这些先前都被报道为头孢地尔耐药的常见驱动因素。添加泽鲁波巴坦将几乎所有转化株的头孢地尔MIC降低至野生型水平，除了产生SHV-12的转化株，其MIC分别为32 mg/L和4 mg/L。尽管SHV-12先前与铜绿假单胞菌和肠杆菌目实验室分离株以及阴沟肠杆菌复合体临床菌株中的头孢地尔耐药相关，但其在铜绿假单胞菌临床菌株中的分布非常有限。因此，预计SHV-12在不久的将来不会成为铜绿假单胞菌中头孢地尔/泽鲁波巴坦耐药的主要机制。

关于产生B类β-内酰胺酶的转化株，头孢地尔/泽鲁波巴坦表现出一定的活性，尽管MIC因特定的酶变体而异。该组合对产生VIM-1、VIM-2、VIM-20和IMP型酶的转化株保持活性，MIC范围在0.125至1 mg/L之间，且泽鲁波巴坦在4和8 mg/L浓度之间未观察到显著差异。这种活性部分归因于头孢地尔对这些酶的内在稳定性，因为该β-内酰胺单独的MIC范围在0.125至2 mg/L之间。与我们研究中包含的其他Ambler类酶的转化株相比，值得注意的是，尽管泽鲁波巴坦已被证明可以增加β-内酰胺对产MBL的等基因肠杆菌目菌株的活性，但其对在铜绿假单胞菌中产生的B类酶的增强效果不太明显。效力降低可能源于多种铜绿假单胞菌特异性因素：限制外膜通透性阻碍抑制剂的摄取；相对于大肠杆菌，对铜绿假单胞菌PBP的内在活性降低；以及通过MexAB-OprM的主动外排，减少泽鲁波巴坦在周质中的积累。

有趣的是，我们的等基因面板包括一个产生IMP-23的铜绿假单胞菌PAO1转化株，其携带V67F氨基酸替换，先前显示会空间阻碍泽鲁波巴坦在活性位点内的定位，从而损害其抑制效果。这种类型的替换，已经存在于流行的IMP变体中，可能对泽鲁波巴坦的效力构成新兴威胁，正如早期评估其与美罗培南联合活性的研究中所报道的。然而，用头孢地尔替代美罗培南（一种被IMP酶微弱水解的抗生素）似乎减轻了此类替换对组合效力的负面影响。尽管如此，类似替换在其他对头孢地尔具有更高内在活性的B类酶中的潜在出现，需要在临床引入时进行密切监测。关于NDM酶，由于其全球传播和强效的头孢菌素酶活性，代表了对头孢地尔最严重的威胁之一，泽鲁波巴坦持续地将所有产NDM转化株的MIC从32->64 mg/L降低至4 mg/L，表明其恢复头孢地尔活性的潜力。尽管4 mg/L的MIC仍高于当前的敏感性折点，但这反映了我们过表达模型中升高的基线MIC。因此，对于缺乏额外耐药机制的临床铜绿假单胞菌NDM-1菌株，头孢地尔/泽鲁波巴坦组合的耐药性不太可能发生，因为大多数流行的产NDM-1铜绿假单胞菌分离株通常产生的头孢地尔MIC在2至16 mg/L之间。最后，产生SPM-1的转化株携带南美最普遍的MBL之一，产生的头孢地尔MIC为16 mg/L，且不受添加泽鲁波巴坦的影响，突出了在该背景下该组合的潜在局限性。

关于产生C类和D类β-内酰胺酶的转化株，头孢地尔和头孢地尔/泽鲁波巴坦均表现出强效活性。添加泽鲁波巴坦倾向于在升高时将头孢地尔MIC降低回野生型水平。值得注意的是，泽鲁波巴坦能够在产生超广谱苯唑西林酶OXA-14和OXA-15的转化株中适度降低头孢地尔MIC，从4 mg/L降至1 mg/L。尽管这些OXA变体流行率不高，但Mack等人最近的一项研究强调，它们各自的亲本酶OXA-10和OXA-2是GenBank中可用的铜绿假单胞菌基因组中最常检测到的β-内酰胺酶。这些酶中在头孢菌素治疗期间选择的特定氨基酸替换与超广谱耐药表型相关，赋予对头孢他啶/阿维巴坦、头孢洛扎/他唑巴坦和头孢地尔的耐药性。因此，泽鲁波巴坦可能为头孢地尔提供额外的保护，并为对抗这些高度耐头孢菌素的铜绿假单胞菌菌株提供有价值的治疗选择。

关于泽鲁波巴坦与坦尼波巴坦相对于头孢吡肟和头孢地尔的相对抑制活性，两者显示出相似的效力，尽管坦尼波巴坦组合对产生某些β-内酰胺酶靶点的菌株略更具活性。关于A类酶，效力差异最大的是产生SHV-12的转化株，其被坦尼波巴坦更强地抑制，头孢吡肟/坦尼波巴坦的MIC值为32 mg/L，头孢地尔/坦尼波巴坦为1 mg/L，而头孢吡肟/泽鲁波巴坦为256 mg/L，头孢地尔/泽鲁波巴坦为4 mg/L。关于MBL，坦尼波巴坦对产生VIM-1、NDM-1和SPM-1的转化株证明更有效。考虑到泽鲁波巴坦对纯化MBL的抑制动力学，除少数例外，优于坦尼波巴坦的报告，比较的MIC值进一步证明了铜绿假单胞菌背景对这种有前途的抑制剂活性的影响。有趣的是，产生D类β-内酰胺酶OXA-1的转化株被基于泽鲁波巴坦的组合更强地抑制，头孢吡肟/泽鲁波巴坦的MIC为4 mg/L，头孢地尔/泽鲁波巴坦为0.125 mg/L，而头孢吡肟/坦尼波巴坦为512 mg/L，头孢地尔/坦尼波巴坦为0.5 mg/L。

泽鲁波巴坦和新型β-内酰胺酶抑制剂对抗铜绿假单胞菌外排突变株的活性

鉴于泽鲁波巴坦对肠杆菌目的内在活性以及先前强调MexAB-OprM外排在限制其效力中作用的报告，我们研究了铜绿假单胞菌PAO1背景中主要耐药结节化细胞分裂型外排系统的破坏和过度生产对泽鲁波巴坦活性的影响。同时，我们将其性能与其他最近批准或研究中的β-内酰胺酶抑制剂进行了比较。在野生型铜绿假单胞菌PAO1背景中，齐德巴坦显示出最大的内在活性，其次是那库巴坦，以及所有剩余的抑制剂。破坏oprM使我们能够评估这些外排系统对铜绿假单胞菌PAO1对这些抑制剂的基线敏感性谱的贡献。有趣的是，阿维巴坦、那库巴坦和齐德巴坦的MIC仅适度降低，而瑞莱巴坦、瓦博巴坦或坦尼波巴坦未观察到变化，强调了这些药物对铜绿假单胞菌缺乏相关的内在抗菌活性。相比之下，泽鲁波巴坦显示出最显著的MIC降低，在oprM缺失后从>256 mg/L降至64 mg/L。这些发现提供了明确的证据，表明尽管其对β-内酰胺酶具有广谱抑制活性，但泽鲁波巴坦在铜绿假单胞菌中面临显著的局限性，至少部分是由于通过RND型外排泵的主动药物挤出所致。

头孢地尔/泽鲁波巴坦对抗临床头孢地尔耐药铜绿假单胞菌菌株的活性及相关耐药机制

为了进一步评估泽鲁波巴坦增强头孢地尔对抗获得头孢地尔耐药机制的临床铜绿假单胞菌分离株活性的能力，我们评估了该组合对99株代表性头孢地尔耐药分离株的效力。这些菌株的头孢地尔和头孢地尔/泽鲁波巴坦的累积MIC分布如表4所示。所有分离株的头孢地尔MIC均>2 mg/L，值范围从4到>128 mg/L。MIC₅₀和MIC₉₀分别为8 mg/L和64 mg/L。添加泽鲁波巴坦显著增强了头孢地尔在整个集合中的活性。使用2 mg/L的暂定折点，头孢地尔/泽鲁波巴坦恢复了78%分离株的敏感性。重要的是，没有分离株对组合的MIC大于16 mg/L。泽鲁波巴坦将头孢地尔的MIC₅₀和MIC₉₀值降低了16倍，最终值分别为0.5和4 mg/L。这些数据支持了泽鲁波巴坦的强效增效作用及其在相当大比例的铜绿假单胞菌临床分离株中克服获得性头孢地尔耐药的潜力。

我们分析了六株头孢地尔/泽鲁波巴坦MIC值>4 mg/L的临床分离株的抗性组，以阐明临床铜绿假单胞菌菌株中头孢地尔/泽鲁波巴坦耐药的驱动因素。这些分离株携带影响铁摄取相关蛋白编码基因的突变或大染色体缺失；通过水平基因转移获得的具有强效头孢菌素酶活性的β-内酰胺酶；以及影响MexAB-OprM调节因子MexR或NalD的改变，与泽鲁波巴坦外排增加相关。这些观察结果证实了从我们的铜绿假单胞菌等基因菌株实验模型得出的结果，即铁摄取受损、β-内酰胺酶和MexAB-OprM外排增加对头孢地尔/泽鲁波巴坦耐药的贡献。相同菌株中这些机制的组合可能将头孢地尔/泽鲁波巴坦组合的MIC增加至4 mg/L以上，限制其对抗铜绿假单胞菌的活性。

Concluding remarks

在此，我们提供了关于新型组合头孢地尔/泽鲁波巴坦对抗具有明确耐药机制的特征明确的铜绿假单胞菌实验室菌株以及大量头孢地尔耐药临床铜绿假单胞菌分离株的性能的先前未报道的数据。我们的研究结果强调，添加泽鲁波巴坦对具有经典染色体编码β-内酰胺耐药机制的铜绿假单胞菌菌株益处有限，对此头孢地尔单独已经表现出高活性。然而，我们在此证明，铁摄取相关基因的失活突变以β-内酰胺酶非依赖性方式显著升高头孢地尔MIC，使得在这些情况下添加泽鲁波巴坦无效。鉴于此类突变在头孢地尔压力下被选择性富集，泽鲁波巴坦作为铁转运缺失驱动耐药的挽救策略的作用可能有限。关于β-内酰胺酶，头孢地尔/泽鲁波巴坦对所有产生所有Ambler类酶的转化株显示出广谱活性，并且与头孢地尔与坦尼波巴坦配对