电荷检测质谱技术在AAV生产过程中的端到端表征研究

《Molecular Therapy Methods & Clinical Development》：End-to-end characterization of AAV manufacturing process using charge detection mass spectrometry

本研究针对重组腺相关病毒（rAAV）生产过程中空壳/部分填充/完整病毒颗粒（E/P/F）的定量分析难题，开发了基于电荷检测质谱（CD-MS）的全程监控方案。通过分析收获液、亲和层析、阴离子交换层析等关键阶段样本，首次实现复杂基质中AAV颗粒的精准质量分辨与电荷特性解析。结果显示CD-MS可同步检测病毒蛋白比例、基因组包装完整性及工艺杂质，为空壳去除工艺优化提供数据支撑，为基因治疗载体质量控制建立新技术标准。

　　

在基因治疗领域，重组腺相关病毒（rAAV）因其安全性高和长期表达特性成为最受欢迎的载体之一。然而，其生产工艺中始终存在一个关键瓶颈：病毒颗粒的异质性。无论是上游的细胞培养、转染，还是下游的纯化过程，都会产生大量空壳（缺乏治疗基因）、部分填充（基因组不完整）和完整病毒颗粒的混合物。这些"无效"病毒不仅无法发挥治疗作用，还可能引发免疫反应，影响治疗效果。更棘手的是，传统分析方法如透射电镜（TEM）和PCR/ELISA组合法，在复杂样品基质（如细胞裂解液）中往往"力不从心"——前者受背景干扰难以识别目标，后者因间接检测而误差累积。当行业亟需一种能够穿透杂质迷雾、直击病毒本质的分析工具时，电荷检测质谱（CD-MS）技术应运而生。

本研究首次系统验证了CD-MS在rAAV全流程生产监控中的应用潜力。通过对AAV9血清型载体从收获液到最终制剂的分析，研究人员发现该技术不仅能准确区分空壳（3.715±0.003 MDa）与完整颗粒（4.898±0.002 MDa），还可识别部分填充颗粒及工艺杂质。特别值得注意的是，CD-MS独创性地构建了质量-电荷二维筛选窗口，即使在高浓度表面活性剂存在的裂解液环境中，也能通过特征电荷区间（0.85-1.2倍瑞利极限）精准锁定目标病毒颗粒。这种"双保险"识别机制，为复杂基质中的AAV定量设立了新标准。

在技术方法层面，研究团队采用静电线性离子阱CD-MS仪器，以104.6毫秒捕获时间测量单个离子的质荷比（m/z）与电荷。样本经200 mM醋酸铵缓冲液置换后，通过纳米电喷雾电离进样。关键创新在于引入脉冲模式CD-MS提升检测灵敏度，并联合 detergent removal column（去垢剂去除柱）预处理技术，有效消除表面活性剂对病毒颗粒电荷信号的干扰。所有实验均设三重重复，确保数据可靠性。

RESULTS

CD-MS分析纯化AAV9-1

通过对高纯度AAV9-1样本的三次重复测量，质谱图显示出高度一致性。空壳颗粒与完整颗粒的质量峰分别位于3.715 MDa和4.898 MDa，峰宽（FWHM）分别为0.135 MDa和0.157 MDa，表明病毒组成均一性良好。电荷-质量散点图进一步揭示，约88%的离子集中在AAV特征区域（Region III），而11.3%的低质量离子归属为工艺杂质。特别在1.14 MDa处发现的尖锐峰，经鉴定为游离基因组DNA，而非宿主染色质残留。

澄清细胞裂解液样本的CD-MS分析

收获液样本的质谱图包含878,727个离子信号，其中绝大多数为低于1 MDa的宿主蛋白和降解DNA。通过二维筛选后，空壳（3.74 MDa）与完整颗粒（5.27 MDa）群体清晰可辨，但存在高质量拖尾现象，归因于表面活性剂吸附。经去垢剂去除柱处理后，病毒信号显著增强，峰宽收窄至0.161 MDa（空壳）和0.184 MDa（完整），证明该方法可有效消除基质干扰。

亲和层析洗脱液分析

切向流过滤（TFF）和亲和层析后，样本中细胞碎片被有效清除。空壳与完整颗粒质量分别为3.722 MDa和5.302 MDa，且二者比例从收获液到纯化阶段保持稳定（15.3%→15.1%），表明亲和层析对E/F比例无偏向性。低于2 MDa的尖锐峰被证实为不完整空壳，而非病毒破裂产物。

阴离子交换层析（AEX）分析

AEX步骤成功将完整颗粒比例从15.3%提升至69.0%，而部分填充颗粒仅从4.9%增至10.6%。值得注意的是，共纯化的空壳质量（3.690 MDa）较理论值偏低，提示其病毒蛋白（VP）比例可能发生变化（如VP1/VP2减少）。完整颗粒质量5.308 MDa与基因组理论值高度吻合，且0.156 MDa的窄峰宽证实DNA包装完整性良好。

端到端工艺监控对比

传统分析方法（如AUC、质谱光度法）与CD-MS数据高度正交。全程监控显示，AEX步骤在实现46%回收率的同时，使宿主细胞蛋白（HCP）降低约6个数量级。CD-MS首次在单一技术平台同步实现病毒滴度、E/P/F比例、杂质残留及聚集态等多属性分析。

本研究证实CD-MS可突破传统分析技术的局限，为rAAV生产提供从细胞裂解液到最终制剂的全程"透视"能力。其核心价值在于：一是直接测量特性避免误差累积，使早期工艺开发中的决策更可靠；二是通过质量-电荷二维解析能力，揭示传统方法无法检测的细节（如VP比例变化、部分填充颗粒行为）；三是为质量源于设计（QbD）理念提供数据支撑，例如发现低pH保留步骤不影响病毒稳定性，以及表面活性剂残留对电荷信号的干扰机制。尽管检测限（LOD）目前为1×10¹⁰颗粒/毫升，但其在工艺稳定性研究、保留时间评估等场景的应用潜力已充分显现。该技术将推动行业从依赖电荷差异的纯化策略，转向基于质量精确分辨的新一代工艺开发，最终为降低基因治疗成本提供关键技术支撑。