头孢布烯与阿维巴坦联合用药对肠杆菌科的稀释法药敏试验方法评估：口服疗法新希望

《Journal of Clinical Microbiology》：Dilution susceptibility testing method evaluation for the combination of ceftibuten and avibactam against Enterobacterales

本刊推荐：本研究遵循CLSI M23 Tier 1指南，系统评估了21种非标准测试条件对头孢布烯/阿维巴坦（CTB/AVI）微量肉汤稀释法（broth microdilution）药敏试验的影响，并首次证实了肉汤稀释法与琼脂稀释法（agar dilution）在检测肠杆菌科（Enterobacterales）对CTB/AVI敏感性方面具有高度一致性（基本一致性≥90%）。该研究为这种新型口服β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂（β-lactam/β-lactamase inhibitor）组合的临床应用提供了可靠的药敏试验方法学依据，对应对产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）肠杆菌科感染具有重要意义。

　　

摘要

随着抗菌药物耐药性（AMR）和多重耐药菌感染的增加，寻找针对不同感染类型和患者群体的额外治疗选择至关重要。许多新近开发的抗生素需要通过静脉注射（IV）给药，这可能不必要地加重医疗系统负担，并且并非对所有患者都是必需或合适的。自2012年以来，产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）的肠杆菌科感染有所增加，并且对用于许多感染（包括复杂性尿路感染）的一线疗法产生耐药性。为了满足对针对产ESBL肠杆菌科的静脉注射疗法替代方案的需求，一种新型的头孢布烯（CTB）和经过修饰的阿维巴坦（AVI）前药版本（ARX-1796）的组合正在被开发，用于口服治疗严重的革兰氏阴性菌感染。由于临床医生通常根据引起患者感染的细菌的药敏谱来处方抗生素——特别是在经验性治疗失败时——建立药敏试验的参数是药物开发的关键阶段。为了解决CTB/AVI参考方法开发中的两个关键空白，本研究遵循CLSI M23 Tier 1指南，调查了非标准测试条件对微量肉汤稀释法试验的影响，以及肉汤稀释法和琼脂稀释法之间的相关性。在评估153株肠杆菌科分离株（包括具有多种抗菌药物耐药机制的最新临床分离株）时，CTB/AVI的两种方法之间显示出高度相关性（基本一致性≥90%）。除了100倍增加的接种物密度和pH 5.0的条件外，CTB/AVI的活性在21种替代的肉汤微量稀释试验条件下基本不受影响。

重要性

全球范围内，迫切需要新的抗生素来应对不断扩大的和新的抗菌药物耐药趋势。虽然药物研发管线中有针对耐药细菌的抗生素，但大多数这些新抗生素没有口服剂型。头孢布烯与阿维巴坦的组合靶向耐药革兰氏阴性菌，包括引起复杂性尿路感染的细菌，并且是口服给药。这种组合为临床医生寻求针对耐药感染患者的合适口服治疗方案填补了空白。在抗感染药物开发过程中，明确药敏试验的变量至关重要，以便临床医生能够自信地评估感染微生物对潜在疗法是耐药还是敏感。本研究评估了头孢布烯联合阿维巴坦针对目标微生物（肠杆菌科）的稀释法药敏试验方法，发现肉汤稀释法和琼脂稀释法试验结果一致，并且除了低pH和接种物大小外，该组合对标准测试参数的大多数变化不敏感。

引言

抗菌药物耐药性（AMR）感染的增加以及用于治疗这些感染的静脉（IV）疗法带来的负担，凸显了持续开发新型口服抗菌药物的必要性。最新的预测估计，到2050年可能发生822万例与AMR相关的死亡，而持续开发针对耐药革兰氏阴性菌分离株的新药可以在未来25年内避免1110万人的死亡。新型抗菌药物的研发管线偏向于静脉疗法，在2023年的管线中，只有不到三分之一（12/40）的抗菌药物设计用于口服给药。当患有严重耐药菌感染的患者需要静脉治疗时，他们要么在住院期间接受治疗，要么在门诊基础上在家由护理人员、在诊所或医院进行给药，这可能会增加医疗系统和患者的负担。由于与静脉治疗相关的负担，将患者从静脉治疗转换为口服治疗的时机是一个不断发展的研究领域，一些研究表明，一旦患者度过危险期，较早过渡到口服治疗会产生与较长静脉治疗持续时间相似的临床结果。因此，努力扩大可口服的新型抗菌药物套件有可能减轻严重感染对患者和医疗系统的影响。

阿维巴坦（AVI）是一种新型的二氮杂双环辛烷β-内酰胺酶抑制剂，靶向超广谱β-内酰胺酶（ESBL），包括A类、C类和一些D类丝氨酸β-内酰胺酶（例如，TEM/SHV, CTX-M, AmpC, KPC, 和OXA）。美国疾病控制与预防中心（CDC）的抗生素耐药性威胁报告将产ESBL肠杆菌科列为自2012年以来频率不断增加的严重威胁。AVI于2015年与头孢他啶（CAZ/AVI）联合获批用于静脉注射，最初用于由肠杆菌科和铜绿假单胞菌引起的尿路感染和腹腔内感染。此外，最近开发了氨曲南（ATM）/AVI组合，以满足ATM和AVI联合活性靶向携带金属β-内酰胺酶（MBL）分离株的需求，用于对抗肠杆菌科和其他严重的革兰氏阴性菌感染。这些最新的β-内酰胺/AVI组合解决了针对严重革兰氏阴性菌感染的新型疗法的需求，但它们并未满足对新型口服疗法的需求。

目前唯一可用的口服β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂是阿莫西林-克拉维酸组合，其在体外对携带ESBL的肠杆菌科分离株有活性，但针对这些微生物的临床使用与治疗失败相关。头孢布烯（CTB）是一种第三代头孢菌素，对许多ESBL的水解作用不敏感，目前正在开发与AVI（CTB/AVI）的组合以靶向严重的革兰氏阴性菌感染。正在开发的配方尤其独特，因为它与新型AVI前药ARX-1796结合，并设计用于口服给药。ARX-1796既满足了靶向产β-内酰胺酶革兰氏阴性菌的需求，也满足了口服制剂的需求。

作为将CTB/AVI推进到药物开发下一阶段的一部分，需要评估测试参数。测试参数是使用Tier 1研究建立的，例如肉汤与琼脂最低抑菌浓度（MIC）值之间的等效性，以及非标准测试条件（培养基pH、表面活性剂、接种物密度等）对测试药物感知活性的影响，遵循CLSI M23的指南。这类研究确保临床实验室——其抗菌药物敏感性试验实践可能有所不同——有能力评估研究性抗菌药物（如CTB/AVI）的抗菌药物敏感性，并且标准方法能够提供稳健可重复的结果。大多数临床实验室使用的自动化系统必须获得美国食品和药物管理局（FDA）的批准，因此，在新的抗菌药物获得FDA批准与其纳入FDA批准的自动化药敏试验系统之间通常存在多年的延迟。最近的变革简化了FDA认可CLSI建立的折点的过程，旨在减少实验室等待设备获批使用的时间，但FDA资金的削减预计会使这一过渡复杂化。因此，全面的参考测试参数的可用性仍然与患者护理相关。

尽管正在开发的口服CTB/AVI制剂使用前药ARX-1796，但抗菌药物敏感性试验必须使用AVI而非ARX-1796进行。先前已确定了AVI在固定浓度4 μg/mL下的测试方法。此外，在临床试验期间使用研究性折点之前，需要设定质量控制（QC）范围，在临床试验中，对试验参与者的分离株进行抗菌药物敏感性试验。CTB/AVI的这些QC范围已通过肉汤微量稀释法建立，并在2023年CLSI M100第33版中临时发布，附带了一份关于缺乏肉汤MIC值与琼脂稀释法测定的MIC值等效性数据的声明，该声明在2025年第35版中仍然存在。在本研究中，我们评估了通过琼脂稀释法测定的CTB/AVI MIC值与肉汤微量稀释法测定的MIC值之间的等效性，以及非标准测试条件对CTB/AVI MIC值的影响。

材料与方法

测试化合物

AVI由辉瑞公司提供，并在水或测试培养基中溶解。CTB由辉瑞公司提供或从Sigma公司购买，并在二甲基亚砜（DMSO）中溶解。虽然CLSI目前推荐的头孢布烯溶剂/稀释剂是0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 8.0）/水或0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 8.0），但DMSO在临床前开发期间常被用作溶剂/稀释剂。事实上，头孢布烯的溶剂/稀释剂过去是10% DMSO/水。如下文所示，CTB/AVI始终在可接受的QC范围内。美罗培南（MEM）从美国药典（USP）获得，并在水中溶解。MEM、CTB和AVI单药的MIC值见附表S1。

测试微生物

本研究中评估的测试微生物包括来自Microbiologics库的非重复、非连续临床分离株，以及来自美国模式培养物集存库（ATCC）、国家模式培养物收藏中心（NCTC）和CDC的参考分离株。总共评估了153株分离株，包括那些为考虑多种不同耐药表型而选择的分离株，包括但不限于各种β-内酰胺酶（BL）和MBL。附表S2提供了可获得信息的分离株的BL含量信息。

肉汤微量稀释法MIC测定（标准格式）

使用CLSI描述的程序通过肉汤微量稀释法测定MIC值。使用的测试培养基是阳离子调节的Mueller Hinton肉汤（CAMHB），在测试CTB/AVI时添加AVI至最终测试浓度4 μg/mL。将分离株从冷冻库存划线到含5%绵羊血的胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）上，并在35°C下孵育过夜以备测试。培养基制备、液体处理、孵育和板读取均按先前描述进行。

肉汤微量稀释法MIC测定（非标准条件）

非标准测试参数在研究期间与标准参数并行评估，如下所述：

pH

在pH 5.0、6.0、7.4（参考pH）和8.0下评估改变的CAMHB测试培养基pH的影响。

接种物效应

制备初始0.5麦氏浊度细胞悬液（约1–2 × 10⁸ CFU/mL）并稀释，以达到最终接种物浓度，目标为测定中5 × 10⁴、5 × 10⁵（参考接种物）、5 × 10⁶和5 × 10⁷ CFU/mL。通过连续10倍稀释并在TSA上划线稀释10 μL来确定细胞密度。将板倾斜以使细胞悬液沿琼脂表面流下。待细胞悬液在琼脂表面干燥后，将板倒置并在35°C下孵育过夜，然后计数菌落形成单位（CFUs）。

孵育气氛

在环境气氛（标准气氛）和存在约5% CO₂的条件下使用标准培养基进行测定。

阳离子补充

通过在不调节的Mueller-Hinton肉汤（MHB）中补充至5 mg/L Ca²⁺和5 mg/L Mg²⁺、25 mg/L Ca²⁺和5 mg/L Mg²⁺、5 mg/L Ca²⁺和12.5 mg/L Mg²⁺、50 mg/L Ca²⁺和25 mg/L Mg²⁺，以及补充至标准25 mg/L Ca²⁺和12.5 mg/L Mg²⁺（参考阳离子补充）的MHB中测定化合物，来确定阳离子的影响。根据CLSI指南，使用10 mg/mL的MgCl₂储备液和10 mg/mL的CaCl₂储备液对MHB进行补充，以达到上述最终Ca²⁺和Mg²⁺浓度。

孵育时间

所评估微生物的标准孵育时间为16至20小时。通过在标准测试培养基中孵育18小时（标准）、24小时和48小时后读取MIC值，确定延长孵育时间对MIC值的影响。

人血清和血清白蛋白补充

在存在和不存在混合人血清和人血清白蛋白的情况下，在标准培养基中进行测定。将过滤灭菌的混合人血清以最终浓度10%和50%（体积/体积）添加到CAMHB中。将人血清白蛋白以最终浓度4%（重量/体积）添加到CAMHB中，并在用于测定前进行过滤灭菌。

尿液

评估在混合正常人尿液和调节至中性pH（7.2–7.4）的混合正常尿液中孵育的影响，并与pH 7.2–7.4的CAMHB以及调节至混合正常人尿液pH（收到时测得为pH 6.8）的CAMHB进行比较。所有溶液在用于测定前进行过滤灭菌。

培养基补充剂

评估在含有3%溶血液（LHB）的培养基和含有0.002%聚山梨酯-80（P-80）的培养基中测试相对于标准培养基的影响。

琼脂稀释法MIC测定

当使用琼脂稀释法测定MIC值时，所有连续稀释和液体处理步骤均使用移液器手动进行。根据CLSI指南制备和稀释用于琼脂稀释的CTB。

将CTB与熔化的（50°C至55°C）Mueller Hinton琼脂（MHA）混合，含或不含4 μg/mL的AVI（测定中的最终浓度）。将CTB以0.3 mL 100X测试剂与29.3 mL琼脂的比例添加。将测试剂添加到无菌管中的琼脂后，轻轻混合，然后倒入无菌方形培养皿（100 × 100 mm）中。让板在室温下凝固，并置于层流罩中，取下盖子以去除琼脂表面的冷凝水。

使用与肉汤微量稀释MIC测试相同的接种物（上述1:10稀释的0.5麦氏浊度悬液），将每种细菌细胞悬液转移到不锈钢复制器块的孔中，在6个独立的运行日进行琼脂稀释评估。

使用不锈钢Steer's复制器在每个含药物或不含药物（对照）的琼脂板上盖章。复制器上的尖齿可向琼脂表面输送约1–2 μL的接种物。产生的接种点含有约10⁴个细胞。将接种后的板放在工作台上，琼脂表面朝上，让接种物渗入琼脂。将板倒置并在35°C下孵育20小时。MIC定义为完全抑制琼脂表面细菌生长的最低测试剂浓度。比较琼脂和肉汤MIC值，并通过将肉汤MIC在琼脂MIC的2倍范围内的分离株百分比分组来确定基本一致性。

结果

替代条件对肉汤微量稀释法测试的影响

在三种大肠杆菌和三种肺炎克雷伯菌分离株上，评估了CTB、AVI和CTB/AVI在总共21种替代测试条件下的情况，包括培养基pH、接种物大小、孵育气氛、孵育时间、二价阳离子浓度以及存在额外补充剂（人血清、人血清白蛋白、尿液、血液和表面活性剂）。MEM的评估浓度范围为0.004至4 μg/mL，低于肺炎克雷伯菌ATCC-BAA-1705的QC范围，因此无法对该分离株和MEM的替代条件进行解释。研究中还包括铜绿假单胞菌ATCC 27853作为MEM的非肠杆菌科QC微生物。

培养基pH

在低pH（5.0和6.0）的培养基中测试时，CTB/AVI的活性相对于标准条件有降低的趋势（表1），这在pH 5.0时对肺炎克雷伯菌分离株最为明显。CTB单药和AVI单药的活性在低pH下也降低（附表S1）。对于MEM，在低pH下，大多数微生物的MIC值在标准条件的4倍范围内，除了测试大肠杆菌ATCC 25922时，在pH 5.0下MIC升高了8倍（附表S1）。

接种物大小

在增加的接种物密度（约10⁷ CFU/mL）下，相对于标准接种物密度，CTB/AVI、CTB单药和AVI单药对所有评估的大肠杆菌和肺炎克雷伯菌分离株的MIC值均升高（表1；附表S1）。在测试所有MEM有活性的分离株时，在最高接种物密度下也观察到MEM MIC值的增加（附表S1）。

孵育气氛和孵育时间

在存在CO₂的情况下孵育，对CTB/AVI、CTB、AVI或MEM对几乎所有评估微生物的活性没有显著影响（表1；附表S1）。例外情况包括在5% CO₂气氛中，CTB单药对大肠杆菌ATCC BAA-2523和AVI对肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705的活性略有下降（附表S1）。

CTB/AVI和MEM的活性不受延长孵育时间的影响（表1）。AVI单药在两种评估的大肠杆菌中，在延长孵育期间MIC值增加（附表S1），但对其他分离株没有影响。除大肠杆菌ATCC BAA-2523外，CTB单药的活性不受孵育时间长度的影响，该菌在延长孵育期间MIC值增加（附表S1）。

改变的二价阳离子浓度

相对于标准浓度，在具有非标准阳离子浓度的培养基中测试时，CTB/AVI、CTB单药、AVI单药和MEM的活性基本不受影响，大多数读数在标准条件的2倍稀释范围内，针对所有评估的分离株（表1；附表S1）。

人血清/白蛋白、尿液、表面活性剂或血液

在存在4%人血清白蛋白的情况下，CTB/AVI MIC值有升高2倍至4倍的趋势（表1）。在CTB单药和MEM有活性的情况下，也观察到类似的结果（附表S1）。测试在存在10%或50%人血清的情况下，对CTB/AVI的活性没有显著影响，MIC值与标准培养基中的相同或在2倍范围内（表1）。在50%血清中，AVI单药的活性在某些情况下较低，特别是在大肠杆菌分离株中，观察到AVI单药的MIC增加了8倍（附表S1）。

在尿液中测试CTB/AVI和CTB通常导致在pH 7和7.4下更低的MIC值（表1）。在所有情况下，AVI和MEM的MIC值都在标准方法的4倍范围内，除了在测试肺炎克雷伯菌ATCC 700603时，AVI单药的MIC值在尿液中降低了16倍（附表S1）。

CTB/AVI、CTB和AVI的活性在存在P-80或3%溶血液的情况下，对所有评估的微生物基本不受影响，只有个别例外（表1；附表S1）。当在测试培养基中添加P-80进行测试时，测试大肠杆菌NCTC 13353时，CTB/AVI MIC值增加了4倍（表1），而测试大肠杆菌ATCC 25922时，AVI单药的MIC增加了>16倍，测试肺炎克雷伯菌ATCC 700603时，MIC降低了4倍（附表S1）。

总之，对每个分离株评估了总共21种替代测试条件。针对四个具有CTB/AVI QC范围的分离株，在替代条件下测试时，分别有2、3、2和4次CTB/AVI MIC值落在QC范围之外。这意味着即使在替代条件下，CTB/AVI在90.5%、85.7%或81.0%的评估中仍在QC范围内。

通过肉汤微量稀释法和琼脂稀释法评估CTB/AVI

方法之间的基本一致性定义为两种方法的MIC值相同或彼此相差在2倍以内。如表2和图1所示，在评估CTB/AVI对肠杆菌科分离株时，两种测试方法之间具有良好的一致性，总体基本一致性为93.6%，按物种划分基本一致性>93%，除了“其他肠杆菌科”（包括沙雷菌属、摩根菌属和普罗威登菌属），其基本一致性为89.5%。当观察到方法之间MIC值差异>4倍时，存在肉汤测试MIC值高于琼脂稀释法的趋势。对于CTB/AVI，未观察到与物种或耐药机制相关的明显不一致趋势。93.6%的总体基本一致性满足了CLSI M23指南中关于建立参考测试方法等效性的≥90%基本一致性的要求。此外，还对四个QC微生物（大肠杆菌ATCC 25922、大肠杆菌NCTC 13353、肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705和肺炎克雷伯菌ATCC 700603）进行了20次重复评估，通过肉汤微量稀释法和琼脂稀释法同时进行接种物评估。所有80个琼脂稀释测试均在可接受的肉汤微量稀释QC范围内（附表S3）。

与CTB/AVI组合相比，CTB单药的肉汤微量稀释法和琼脂稀释法MIC值之间的一致性较低，如表2和图1和图2所示。肠杆菌科总体两种测试方法的基本一致性为80.3%，大多数测试物种的基本一致性在70%至90%之间，除了变形杆菌属，其基本一致性为57.9%。值得注意的是，在通过肉汤测试变形杆菌属时观察到严重的拖尾现象，而琼脂法则没有。有五次BMD和AD方法观察到的CTB MIC值差异≥16倍，这归因于四株变形杆菌属分离株和一株摩根摩根菌分离株（附表S2）。与CTB/AVI组合一样，>4倍的MIC差异是由肉汤MIC值高于琼脂稀释MIC值驱动的。在导致CTB不一致的六株大肠杆菌分离株中，有五株携带TEM（可切割AVI的A类BL）。未观察到与其他物种或表型相关的明显不一致趋势。

讨论

在本研究中，在测试的非标准测试参数中，CTB/AVI MIC值仅受培养基pH和接种物密度的影响，并且在CTB/AVI针对肠杆菌科测试时，琼脂稀释法和肉汤微量稀释法MIC值基本等效。本研究选择的分离株包括广泛的耐药表型，特别是那些携带BL的分离株，以更好地评估该组合和AVI的抑制活性。与CTB或AVI单药相比，CTB/AVI对BL阳性分离株的MIC值降低（表1；附表S1），证实了CTB和AVI组合针对这些BL阳性分离株的预期协同作用。

CTB/AVI的活性受到低培养基pH和增加的接种物大小的负面影响，针对所有评估的微生物（表1）。对于通过先前研究建立QC范围的微生物，在pH 5.0的培养基和高接种物的测试板中，CTB/AVI MIC值超出了已建立的QC范围。虽然pH 6.0的培养基通常会增加MIC值，但QC微生物仍在CLSI建立的可接受MIC范围内。在高接种物存在下活性降低并不令人惊讶，因为接种物效应是β-内酰胺类药物的已知现象。

与低pH和高接种物大小相比，本研究中其他对标准测试参数的改变对CTB/AVI活性的影响较小，包括孵育气氛、孵育时间、培养基中二价阳离子浓度的变化以及培养基pH升高（表1）。对于四个具有CTB/AVI QC范围的分离株，在21个总替代测试条件中，只有2到4个导致CTB/AVI MIC值超出QC范围。当测试培养基中存在人血清、表面活性剂或血液，或者板中含有尿液代替培养基时，在某些情况下对CTB/AVI活性的影响轻微，标准和非标准测试条件之间的活性差异为4倍。

针对富含BL阳性分离株的群体，CTB/AVI肉汤微量稀释法和琼脂稀释法之间的基本一致性总体较高（93.6%；表2）。大多数CTB/AVI肉汤微量稀释和琼脂稀释MIC值在两种方法下相同或相差在一个倍比稀释度内，超过一半的测试分离株在两种方法下观察到相同的MIC值（附表S1）。CTB单药对变形杆菌属的严重拖尾解释了CTB单药观察到的高度不一致；在评估CTB/AVI的肉汤和琼脂方法时，既未观察到拖尾也未观察到不一致，这是本研究的主要重点（表2；附表S1）。

随着AMR的上升和ESBL的威胁，针对不同感染类型的新型疗法变得越来越重要。根据CDC新发感染项目，2021年只有三分之一的产ESBL肠杆菌科病例需要住院治疗，这表明需要一种口服抗生素来应对大多数此类病例。扩大针对产ESBL肠杆菌科感染（包括复杂性尿路感染）的口服治疗选择，将为临床医生提供新的治疗选择，以应对这类感染日益严重的问题。本研究通过展示替代测试条件对活性的影响，提供了CTB/AVI肉汤微量稀释法测试性能的透明度，并表明琼脂稀释法是该组合合适的药敏试验方法。这一信息对于寻求测试尚未纳入自动化抗菌药物敏感性试验系统的新抗菌药物的实验室来说是关键资源。总体而言，CTB/AVI在本研究中得到了稳健的测试，肉汤和琼脂方法之间具有很强的相关性，并且对标准肉汤条件的改变大多对MIC值影响很小。

致谢

本研究由辉瑞公司赞助。Microbiologics从辉瑞公司获得了与本研究和本手稿开发相关的财务支持。