阿米巴脓肿血清学诊断：欧洲市场四种商业化试剂盒的回顾性诊断准确性研究

《Journal of Clinical Microbiology》：Serodiagnosis of amoebic abscess: a retrospective diagnostic accuracy study of kits marketed in Europe

本研究对欧洲市场四种阿米巴脓肿血清学诊断试剂盒（Bordier/Novatec ELISA、ELI.H.A Amoeba IHA、ELITex Bicolor Amoeba LA）进行多中心回顾性评估，证实组合策略（高灵敏度ELISA/IHA初筛+高特异性LA确认）可实现最优诊断性能（灵敏度97.5%，特异性99.7%），为临床微生物实验室试剂选择提供了关键循证依据。

　　

ABSTRACT

阿米巴病是一种由溶组织内阿米巴引起的世界性寄生虫病，其最致命的类型是肠外阿米巴病，主要表现为肝脓肿。诊断依赖于临床、影像学和生物学检测。然而，目前欧洲市场上可用于体外诊断的血清学试剂有限，且需要对现有试剂进行比较研究。本研究评估了四种现有试剂的性能，包括单独使用或组合使用。评估的试剂包括两种检测^E. histolytica IgG的酶联免疫吸附测定试剂盒（分别由Bordier和NovaTec生产），以及ELITech Microbio生产的间接血凝试剂ELI.H.A Amoeba和乳胶颗粒凝集试剂ELITex Bicolor Amoeba。研究从法国七所大学医院的共享中心化生物样本库中选取了442份血清样本，包括79例阿米巴脓肿患者、13例阿米巴结肠炎患者以及350例健康捐献者和患有寄生虫病及非寄生虫病（特别是肝病和免疫功能障碍）的患者样本。四种试剂盒的灵敏度在87.3%至97.5%之间，特异性在78.3%至98.6%之间。Bordier ELISA显示出最高的灵敏度，而ELITex Bicolor Amoeba乳胶试剂则表现出最高的特异性。采用Bordier ELISA和/或ELI.H.A Amoeba进行筛查，并结合ELITex Bicolor Amoeba对筛查阳性结果进行确认的组合策略，获得了最优的性能。本研究强调了大型商业化试剂盒比较研究对于指导临床微生物学家选择的重要性。

IMPORTANCE

由溶组织内阿米巴引起的阿米巴病在社会经济水平较低的国家很常见。最致命的类型是肠外阿米巴病，主要是肝脓肿，需要快速准确的诊断。诊断基于临床、影像学，最重要的是血清学检测。实施诊断策略既需要了解不同诊断检测方法之间的比较，也需要进行彻底的交叉验证。为了帮助临床微生物学家选择血清学试剂，我们利用来自法国七所大学医院的大型血清生物样本库，评估了目前欧洲市场上四种血清学试剂的性能。除了阿米巴脓肿患者和健康捐献者，我们的研究还纳入了许多患有其他寄生虫和非寄生虫疾病（肝病、免疫功能障碍）患者的样本，以特别研究非特异性反应。

INTRODUCTION

阿米巴病是一个重大的全球健康问题，死亡率很高。在5亿感染^Entamoeba spp.的个体中，10%感染了溶组织内阿米巴，这是目前已知唯一对人类致病的物种。侵袭性阿米巴病，包括阿米巴肝脓肿，每年导致5万至7万人死亡。在非流行地区，旅行者和移民是主要受影响人群。阿米巴病的诊断面临重大挑战。消化道形式可能被误诊为炎症性肠病，区分阿米巴肝脓肿和化脓性肝脓肿也很困难。这一诊断挑战可能导致延迟和/或不恰当的处理。血清学主要用于侵袭性溶组织内阿米巴感染的诊断。随着欧洲关于体外诊断医疗器械法规的趋严，一些诊断试剂已停止分销，导致阿米巴脓肿的商业化检测数量急剧减少。因此，需要根据实验室需求重新评估现有试剂，以实施适当的诊断策略。

MATERIALS AND METHODS

本研究涉及法国的七个寄生虫学-真菌学实验室。血清样本由各实验室在过去10年内收集，未经过反复冻融。样本集中保存在贝桑松血清学实验室的生物样本库中，于-20°C保存直至检测。为确保完整性，如果结果与使用相同技术获得的初始结果不一致，则排除样本。为评估灵敏度或特异性为95%时所需的样本量，设定α风险为0.05，边际误差为0.05，计算得出所需总样本量为73例。共选取442份血清样本（每位患者选取一份血清样本）。阿米巴脓肿组的诊断标准是结合阳性阿米巴常规血清学结果、一致的流行病学、影像学表现以及甲硝唑治疗成功。如果可用，阳性分子生物学结果也是一个支持论据。评估了四种商业化试剂盒：ELITex Bicolor Amoeba（乳胶凝集）、ELI.H.A Amoeba（间接血凝）以及两种溶组织内阿米巴IgG ELISA试剂盒（Bordier和NovaTec）。由同一操作者在单中心盲法操作。通过2×2列联表计算灵敏度、特异性、似然比、曲线下面积和准确性等参数。还评估了结合两种技术的血清学诊断策略。使用接收者操作特征曲线和约登指数确定每种ELISA检测的最适阈值。

RESULTS

研究人群包括442名患者。阿米巴脓肿组有79例患者，主要为阿米巴肝脓肿，男女比例为5.6，中位年龄为41岁。为分析试剂盒性能，还纳入了患有其他寄生虫病、免疫功能障碍、肝病或非相关孤立性阳性血清学的患者以及健康捐献者。四种试剂盒的灵敏度在87.3%至97.5%之间。Bordier ELISA是最灵敏的技术，仅有2份血清样本出现假阴性。ELI.H.A Amoeba的灵敏度与Bordier ELISA相当。ELITex Bicolor Amoeba的灵敏度相对较低（89.9%）。ELITex Bicolor Amoeba显示出最高的特异性（98.6%），假阳性结果最少。ELI.H.A Amoeba的特异性接近ELITex Bicolor Amoeba（98.0%）。Bordier ELISA的特异性低于上述方法。NovaTec ELISA观察到76例假阳性血清样本，导致其特异性最低。许多假阳性结果出现在一种或两种ELISA方法中，而LA和IHA方法的假阳性结果很少。假阳性结果主要出现在肝病或免疫功能障碍疾病组患者的血清样本中。通过ROC曲线分析优化了ELISA检测的阈值。对于Bordier ELISA，最佳约登指数为0.9，对应的ELISA阈值指数为1.554。对于NovaTec ELISA，最佳约登指数为0.74，对应的ELISA阈值为14.1 NTU。优化后的阈值在不增加假阴性的情况下降低了两种方法的假阳性值。Bordier ELISA的特异性提高至95.4%，NovaTec ELISA的特异性提高至95.1%。评估了血清学诊断策略。结合两种高灵敏度筛查试剂盒（Bordier ELISA和IHA）可将灵敏度提高至97.5%。采用最灵敏的技术（Bordier ELISA和/或IHA）进行筛查，并用LA技术确认阳性结果，可获得99.7%的特异性和最高的验后概率。在13例阿米巴结肠炎患者样本中，8例所有检测技术均呈阳性，3例所有技术均呈阴性。

DISCUSSION

本多中心回顾性准确性研究的结果表明，Bordier ELISA和ELI.H.A Amoeba在溶组织内阿米巴血清学诊断中表现出最高的灵敏度。ELITex Amoeba LA试剂盒具有最高的特异性值，与ELISA试剂盒相比假阳性发生率低。当LA方法与两种灵敏技术之一结合使用时，特别是ELISA技术观察到的假阳性结果得到改善。此外，本研究使用的大量血清样本队列使得建立改进的ELISA阈值并减少假阳性结果成为可能。与先前报道相比，本研究中Bordier ELISA的特异性较低，可能归因于队列中血清的多样性。ELI.H.A Amoeba技术的性能与先前报道相似。ELITex Amoeba在本研究中对阿米巴脓肿诊断的灵敏度低于Bordier ELISA和ELI.H.A Amoeba。NovaTec ELISA表现出次优的灵敏度和特异性。先前准确性评估研究稀少且相对陈旧，观察到的性能差异可归因于试剂生产的变异。本研究存在局限性，例如所有检测在单中心进行，可能人为提高了血凝技术的性能。研究设计为回顾性，高收入国家阿米巴脓肿患病率极低，无法进行前瞻性研究。然而，纳入血清的多样性是本研究的主要优势。优化ELISA方法的阳性阈值有助于解决在特定人群（如粪菌捐献者筛查）中假阳性导致捐赠被拒的问题。本研究还揭示，阳性血清学结果常与阿米巴结肠炎相关，尽管血清学不适用于该临床形式的诊断。

总之，需要大型比较研究来指导临床微生物学家的选择。对于像阿米巴脓肿这样在常规实践中罕见的寄生虫病而言，这一点更为重要。在低收入和中等收入国家，试剂选择还受到实验室设备和试剂可用性的影响。本研究为理想情况下应进行的前瞻性多中心准确性研究提供了基线数据。