基于多重PCR技术快速检测阳性血培养液中革兰氏阴性菌耐药基因的前瞻性评估与模拟管理研究

《Journal of Clinical Microbiology》：Rapid detection of gram-negative antimicrobial resistance determinants directly from positive blood culture broths using a multiplex PCR system

本研究前瞻性评估了原型BIOFIRE FILMARRAY抗菌耐药（AMR）Panel，这是一种可在约1小时内直接从阳性血培养肉汤中检测31种AMR基因的快速多重PCR检测方法。结果表明，该Panel能准确预测大肠杆菌（Escherichia coli）和肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）对多数抗菌药物的耐药性，模拟管理研究显示其应用可显著优化β-内酰胺类药物的升级或降级时机，为改善血流感染患者的临床治疗和抗菌药物管理提供了有力工具。

　　

ABSTRACT

目前可用的快速血培养诊断方法检测的革兰氏阴性耐药决定因子很少，限制了其临床实用性。我们前瞻性评估了原型BIOFIRE FILMARRAY抗菌耐药（AMR）Panel，这是一种快速多重PCR测试，可在约1小时内直接从阳性血培养肉汤中检测31种AMR基因。研究对象为纽约市一家医院由五种目标病原体引起的革兰氏阴性菌血症患者的残留阳性血培养肉汤。将基于AMR Panel预测的抗菌药物耐药性与血培养分离株的肉汤微量稀释（BMD）测试结果进行比较。一项模拟管理研究评估了如果AMR Panel结果能够实时用于患者护理，优化治疗的机会。

我们纳入了148名革兰氏阴性菌血症患者（大肠杆菌75例；肺炎克雷伯菌44例；铜绿假单胞菌17例；阴沟肠杆菌复合体9例；鲍曼不动杆菌3例）。对于大肠杆菌，AMR Panel预测抗菌药物耐药性的敏感性在14种抗菌药物中的10种≥90%；对于肺炎克雷伯菌，在16种抗菌药物中的10种≥90%。对于大肠杆菌，特异性在17种抗菌药物中的15种≥90%；对于肺炎克雷伯菌，在所有16种抗菌药物中均≥90%。对其他生物体的检测性能较差。对于大肠杆菌或肺炎克雷伯菌菌血症，与实际情况相比，使用AMR Panel本可以导致大多数患者更早地升级或降级β-内酰胺治疗。这项研究表明，具有大量AMR基因菜单的快速多重PCR测试可以应用于阳性血培养肉汤，以快速预测大肠杆菌或肺炎克雷伯菌菌血症患者对一线抗菌药物的耐药性。

INTRODUCTION

由革兰氏阴性菌血症引起的脓毒症患者需要及时有效的抗菌治疗，因为延迟适当治疗会迅速增加死亡风险。不幸的是，对经验性治疗的抗菌药物耐药很常见，尤其是随着产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）细菌的出现。传统的血培养诊断需要在培养呈阳性后再花费2-3天才能获得药敏试验（AST）结果。这些延迟导致抗菌药物耐药病原体感染患者的预后更差，因为有效治疗被延迟。此外，感染高度敏感病原体的患者可能会多接受2-3天不必要的广谱治疗，这加剧了抗菌药物耐药性问题。因此，需要更快地识别血培养中的抗菌药物耐药细菌以改善患者预后和抗菌药物管理。

为解决此问题，已开发出可直接从阳性血培养肉汤中快速识别常见革兰氏阴性血流病原体和有限数量抗菌药物耐药决定因子的分子检测Panel。这些Panel通常检测最常见的碳青霉烯酶和/或单个ESBL基因，bla_CTX-M。然而，它们不检测TEM和SHV型ESBL或窄谱β-内酰胺酶基因（如bla_TEM-1）、AmpC β-内酰胺酶基因或介导氟喹诺酮类或氨基糖苷类耐药的基因。这种革兰氏阴性抗菌药物耐药性综合信息的缺乏限制了这些分子检测对患者护理产生积极影响的能力。

原型BIOFIRE FILMARRAY抗菌耐药（AMR）Panel通过更全面地检测革兰氏阴性菌的遗传性抗菌药物耐药决定因子，对当前的分子检测Panel进行了改进。在本研究中，我们评估了该原型检测方法在直接应用于阳性血培养肉汤时，预测革兰氏阴性血流病原体AST结果的临床性能。为评估AMR Panel的潜在临床影响，我们还进行了一项模拟管理研究，以评估如果AMR Panel的结果能够实时提供给患者护理团队，可能存在的抗菌药物升级和降级机会。

MATERIALS AND METHODS

研究设计

这项前瞻性观察性研究在2018年12月至2019年4月期间，于纽约长老会/威尔康奈尔医学中心招募了患者。这些患者的阳性血培养经BIOFIRE FILMARRAY血培养鉴定（BCID）Panel鉴定为大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌复合体、铜绿假单胞菌或鲍曼不动杆菌。BCID Panel检测10种革兰氏阴性细菌 species、1个科和1个革兰氏阴性抗菌药物耐药基因bla_KPC，并且在研究期间是阳性血培养标准临床工作流程的一部分。BCID Panel将肺炎克雷伯菌和差异克雷伯菌均报告为肺炎克雷伯菌。如果需氧或厌氧瓶中有生长，BCID Panel仅鉴定出单一病原体，并且有≥1.5 mL残留血培养肉汤可用，则患者及其血培养标本被纳入研究。仅评估每位患者的首次合格发作，并排除从培养中回收多种细菌病原体的标本。阳性血培养的等分试样在报阳后24小时内于-80°C冷冻，随后在AMR Panel上进行评估。从血培养中回收的细菌分离株被冷冻，并在JMI实验室使用含有17种抗菌药物的冷冻Panel进行参考肉汤微量稀释（BMD）AST。这作为AMR Panel性能的参考比较标准。

我们查阅了医院的电子病历以获取研究对象的临床数据，包括人口统计学、合并症、标准微生物学检查的时间安排、患者位置和临床状态、菌血症来源、抗菌治疗、住院时间和死亡率。

AMR Panel检测和结果解读

AMR Panel需要大约5分钟的手动操作时间，并在封闭系统中执行核酸提取、巢式PCR扩增和扩增子熔解曲线分析，在大约1小时内得出结果。它包括47个检测项目，针对31个基因，这些基因介导对青霉素类、β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂复合制剂、头孢菌素类、氨曲南、碳青霉烯类、氨基糖苷类和环丙沙星的耐药性。这些PCR检测在stage 1和巢式stage 2 PCR反应中靶向AMR基因的高同源性区域。

在本研究中，将200 μL阳性血培养肉汤加入到含有800 μL BIOFIRE FILMARRAY样品缓冲液的BIOFIRE FILMARRAY样品过滤注射小瓶中。然后将其密封、倒置并注射到水合的AMR Panel试剂袋中。加载的试剂袋在BIOFIRE Torch系统上进行测试。使用终点熔解曲线分析生成结果。耐药性特征是根据表1中概述的特定AMR标记物的检测来确定的。由单核苷酸多态性变体介导的耐药性通过比较野生型和突变体检测之间的循环阈值（Ct值）来表征。

AMR Panel性能

对于每个标本，我们将阳性血培养肉汤上进行的AMR Panel结果（基于表1中耐药决定因子的存在或 absence，判断为敏感或耐药）与培养回收分离株的BMD AST结果进行比较。计算了每种生物体对最多17种抗菌药物的敏感性（在BMD显示不敏感的标本中，AMR Panel报告耐药结果的标本比例）、特异性（在BMD显示敏感的标本中，AMR Panel报告敏感结果的标本比例）、阳性预测值（当AMR Panel报告耐药时，BMD显示不敏感分离株的预测价值）和阴性预测值（当AMR Panel未报告耐药时，BMD显示敏感分离株的预测价值）。选择这些性能特征作为主要分析，而不是分类一致性和错误率，因为AMR Panel是预测耐药性，而不是一种AST方法。此外，AMR Panel是与参考方法（培养回收分离株的BMD AST）进行比较，因此我们认为敏感性和特异性比阳性符合率和阴性符合率更合适。BMD的中间结果与耐药结果归为一组，因为AMR Panel没有中间类别。如果同一培养物中回收了目标生物体的多个分离株，则对每种抗菌药物使用耐药性更强的分离株作为参考标准。作为补充分析，我们还计算了重大错误（在BMD显示耐药的标本中，AMR Panel报告敏感结果的比例）和主要错误（在BMD显示敏感的标本中，AMR Panel报告耐药结果的比例）。由于AMR Panel缺乏中间结果，无法计算轻微错误和分类一致性。

针对大肠杆菌和肺炎克雷伯菌菌血症的模拟管理评估

原型AMR Panel的结果未向患者护理团队报告，因此我们无法评估该检测的临床影响。相反，我们开发了一种算法来识别潜在的抗菌治疗升级或降级机会，假设在BCID Panel鉴定出革兰氏阴性菌后立即进行AMR Panel检测，AMR Panel结果在BCID Panel结果后2小时内报告给患者护理团队，并且临床医生在收到AMR Panel结果后1小时内根据此信息采取行动。我们将此分析重点放在两种最常见的革兰氏阴性血流分离株：大肠杆菌和肺炎克雷伯菌上。如果血培养标本中存在ESBL或AmpC β-内酰胺酶基因，我们评估使用AMR Panel结果是否可能比仅使用BCID检测结果实际发生的情况更早地将患者升级至碳青霉烯类治疗。如果不存在ESBL或AmpC β-内酰胺酶基因，我们评估患者是否可能比实际发生的情况更早地从更广谱的抗假单胞菌β-内酰胺类药物（如哌拉西林-他唑巴坦、头孢吡肟或碳青霉烯类）降级至更窄谱的药物（如头孢曲松）。

RESULTS

研究队列

我们招募了148名因目标病原体导致菌血症的独特患者。患者中位年龄为69岁（IQR 55-78）。46%的患者为女性，38%为非白种人或种族未知，9%为西班牙裔/拉丁裔。最常见的合并疾病是血液系统恶性肿瘤（22%的患者）、糖尿病（21%）和实体瘤（19%）。最常见的菌血症来源是尿路（45%的患者）和腹腔内（24%）。当BCID Panel结果发布时，针对革兰氏阴性菌的最常见抗菌治疗是哌拉西林-他唑巴坦（54%的患者）、美罗培南（13%）和头孢曲松（8%）。随后在培养中分离出的细菌菌株在74%的患者中对此时正在进行的抗菌治疗敏感。13名（9%）患者在血培养采集后30天内死亡。

血流分离株和血培养肉汤中检测到的基因

在148株血流分离株中，75株（51%）为大肠杆菌，44株（30%）为肺炎克雷伯菌，9株（6%）为阴沟肠杆菌复合体，17株（11%）为铜绿假单胞菌，3株（2%）为鲍曼不动杆菌。11份（7%）血培养中回收了同一物种的两种不同形态。通过BMD AST检测，对每种抗菌药物耐药的分离株比例如表S2所示。头孢曲松耐药分别在大肠杆菌22株（29%）、肺炎克雷伯菌10株（23%）、阴沟肠杆菌复合体6株（67%）和鲍曼不动杆菌2株（67%）中发现。未在大肠杆菌中检测到美罗培南耐药，但在肺炎克雷伯菌4株（9%）、阴沟肠杆菌复合体2株（22%）、铜绿假单胞菌2株（12%）和鲍曼不动杆菌1株（33%）中检测到。

AMR Panel在41份（28%）血培养肉汤中检测到TEM-1，在37份（25%）中检测到SHV-1。总共有27份（18%）肉汤标本携带CTX-M，4份（3%）携带TEM或SHV ESBLs。在5份（3%）和15份（10%）标本中分别鉴定出AmpC β-内酰胺酶和OXA-1。7份（5%）标本携带碳青霉烯酶。gyrA基因83位密码子的突变是最常见的氟喹诺酮耐药决定因子（n = 51, 35%），aac(6′)-Ib-cr是最常见的氨基糖苷类耐药决定因子（n = 16, 11%）。

原型AMR Panel的性能

AMR Panel预测血流分离株AST结果的性能因物种和抗菌药物而异。对于大肠杆菌，检测耐药分离株的敏感性对大多数抗菌药物≥90%，但阿莫西林-克拉维酸（65%）、头孢唑林（62%）、头孢西丁（40%）和头孢他啶（89%）除外。特异性（检测敏感菌株）对所有药物均≥90%，但氨苄西林-舒巴坦（88%）和环丙沙星（81%）除外。对于肺炎克雷伯菌，检测耐药分离株的敏感性对大多数抗菌药物≥90%，但氨苄西林-舒巴坦（85%）、哌拉西林-他唑巴坦（80%）、头孢唑林（71%）、头孢西丁（63%）和环丙沙星（83%）除外。检测敏感肺炎克雷伯菌的特异性对所有药物均≥90%。对于大肠杆菌和肺炎克雷伯菌，检测耐药的阴性预测值对所有药物均≥90%，头孢唑林除外。重大错误和主要错误如表4所示。

AMR Panel未检测到铜绿假单胞菌对大多数抗菌药物的耐药性，并且对阴沟肠杆菌复合体检测耐药性的敏感性对大多数抗菌药物<85%。该检测在唯一携带碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌的血培养肉汤中检测到OXA-23，但由于样本量小，未计算鲍曼不动杆菌的性能特征。

模拟管理

有119名因大肠杆菌或肺炎克雷伯菌导致菌血症的患者符合模拟管理分析的条件。1名患者感染了产NDM的肺炎克雷伯菌，如果原型AMR Panel在BCID Panel之后进行并得到执行，该患者本可以提前33小时升级至活性治疗。27名患者的分离株携带ESBL或AmpC β-内酰胺酶且临床数据可用。如果AMR Panel在BCID Panel之后立即进行，并且在AMR Panel结果发布后1小时内对接受头孢菌素、氨苄西林-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦或氨曲南治疗的患者给予碳青霉烯类治疗，那么这些患者中的18名（67%）本可以比实际发生的情况更早（中位时间提前32小时，IQR：26-47）升级至碳青霉烯类治疗。1名患者本会被不恰当地升级至碳青霉烯类治疗，因为尽管AMR Panel检测到CTX-M，但血流分离株对头孢曲松敏感。

86名患者感染了大肠杆菌或肺炎克雷伯菌血流分离株，这些分离株不携带碳青霉烯酶、ESBL或AmpC β-内酰胺酶，且临床数据可用。这些患者中的45名（52%）在BCID结果发布后继续使用抗假单胞菌β-内酰胺药物，并在AST结果可用后24小时内降级至更窄谱的β-内酰胺药物。因此，估计如果AMR Panel结果在BCID Panel之后、下一次β-内酰胺药物剂量到期之前可用，这些患者本可以比实际发生的情况中位提前34小时（IQR：29-42）降级至更窄谱的药物。1名患者本可能被不恰当地降级至头孢曲松，因为尽管AMR Panel未检测到头孢曲松耐药标记物，但血流分离株显示对头孢曲松中度敏感。

DISCUSSION

我们进行这项研究是为了确定AMR Panel（一种使用BIOFIRE FILMARRAY平台检测31种抗菌药物耐药决定因子的原型分子检测）在直接应用于阳性血培养肉汤时，预测五种常见革兰氏阴性菌血症病原体抗菌药物耐药性的能力。我们发现，对于大肠杆菌和肺炎克雷伯菌，检测大多数抗菌药物耐药性的敏感性和特异性均>90%，并且AMR Panel上的“敏感”结果（基于未检测到耐药决定因子）对所有药物（头孢唑林除外）的耐药性阴性预测值>90%。如果AMR Panel可用并在BCID Panel结果后作为反射检测进行，大多数大肠杆菌和肺炎克雷伯菌感染者本可能根据是否检测到ESBL或AmpC β-内酰胺酶，更早地升级至碳青霉烯类治疗或从抗假单胞菌β-内酰胺类药物更早降级。相比之下，AMR Panel在预测铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌复合体和鲍曼不动杆菌的抗菌药物耐药性方面性能有限。

像原型AMR Panel这样快速、高度多重化的PCR检测能够直接应用于阳性血培养肉汤，在大约1小时内预测大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的抗菌药物耐药性，这一点非常重要，因为这两种病原体在美国引起了三分之二的革兰氏阴性菌血症。当前美国食品药品监督管理局（FDA）批准的用于血培养的分子检测Panel，如BCID2 Panel，检测碳青霉烯酶和单个ESBL，CTX-M。原型AMR Panel通过额外检测介导头孢曲松耐药的ESBL和窄谱TEM及SHV β-内酰胺酶，以及AmpC β-内酰胺酶（如CMY、MOX和DHA），扩展了这些靶标。虽然CTX-M是最常见的ESBL，但我们也鉴定出三株CTX-M阴性且对头孢曲松不敏感的分离株，它们要么有ESBL SHV（1株肺炎克雷伯菌），要么有AmpC β-内酰胺酶（1株携带CMY的大肠杆菌和1株携带DHA的肺炎克雷伯菌）。使用当前FDA批准的分子血培养Panel会漏掉这些头孢曲松耐药标记物。

一项对美国56家医院的2277株大肠杆菌和751株肺炎克雷伯菌分离株（这些菌株对碳青霉烯类敏感但头孢菌素或氨曲南最低抑菌浓度（MIC）值升高）的研究发现，这些大肠杆菌和肺炎克雷伯菌分离株中分别有15%和23%不携带CTX-M。在CTX-M阴性的大肠杆菌分离株中，67%携带CMY或DHA，8%携带SHV或TEM ESBL，这些都是原型AMR Panel检测的靶标。在CTX-M阴性的肺炎克雷伯菌分离株中，78%携带SHV ESBL，16%携带CMY或DHA，2%携带TEM ESBL。检测这些ESBL和AmpC β-内酰胺酶具有重要的临床意义，因为碳青霉烯类是推荐用于由产这些酶的微生物引起的菌血症的治疗，它们的检测可能导致更早的适当治疗。此外，考虑到头孢菌素MIC升高的CTX-M阴性分离株占相当大比例，如果临床医生知道血培养没有任何AMR Panel上的ESBL或AmpC耐药决定因子，而不是仅仅知道没有CTX-M，他们可能更愿意快速从哌拉西林-他唑巴坦、头孢吡肟或碳青霉烯类降级至头孢曲松。

值得注意的是，AMR Panel未能可靠地检测大肠杆菌和肺炎克雷伯菌对头孢唑林的耐药性，以及大肠杆菌对阿莫西林-克拉维酸的耐药性。尽管原因尚不清楚，但这凸显了导致这些微生物对这些抗菌药物耐药的复杂因素。例如，最近一项研究发现，相当一部分不携带ESBL的大肠杆菌和肺炎克雷伯菌分离株对头孢曲松敏感但对头孢唑林不敏感。

像原型AMR Panel这样的检测与当前使用的Panel相比的另一个潜在优势是检测氟喹诺酮类耐药性。虽然β-内酰胺类药物是最常见的经验性治疗，但氟喹诺酮类可能用于有严重青霉素过敏的患者。此外，氟喹诺酮类是治疗尿路感染引起的菌血症的有效药物，而尿路感染是革兰氏阴性菌血症最常见的来源，并且它们具有高口服生物利用度，允许从静脉给药向口服给药的快速转换，并可能实现更早出院。在本研究中，AMR Panel未在33株大肠杆菌中的3株和12株肺炎克雷伯菌中的2株中鉴定出表型环丙沙星耐药。AMR Panel检测gyrA基因83位密码子和parC基因80位密码子的突变。虽然这些是肠杆菌目中介导环丙沙星耐药的最常见突变，但gyrA和parC的其他突变、外排泵以及阻止环丙沙星到达其靶点的酶也可能导致环丙沙星耐药。需要进一步研究以更好地了解额外的耐药决定因子，将这些因子加入该多重化Panel将能更全面地检测环丙沙星耐药。

尽管原型AMR Panel在检测大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的耐药性方面前景广阔，但对于检测铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌复合体和鲍曼不动杆菌的耐药性用处较小。铜绿假单胞菌对β-内酰胺类的耐药主要不是由AMR Panel的靶标机制介导，例如假单胞菌衍生的头孢菌素酶、外膜孔蛋白修饰和外排泵。阴沟肠杆菌复合体成员携带染色体AmpC β-内酰胺酶，对第三代头孢菌素的耐药通常发生在接触某些抗生素后这些酶产量增加的情况下。这些多样化的耐药机制对设计用于检测铜绿假单胞菌和阴沟肠杆菌复合体耐药性的多重PCR Panel构成了重大挑战。

这项研究存在局限性。它是一项单中心研究，因此，革兰氏阴性血流分离株的流行病学和耐药决定因子在其他机构可能有所不同。菌血症由铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌复合体和鲍曼不动杆菌引起的患者数量少，限制了对这些生物体性能估计的精确性。该研究仅评估了经BCID鉴定为单一革兰氏阴性病原体的血培养。尚不清楚该检测在应用于含有多种革兰氏阴性病原体的血培养时表现如何。最后，鉴于原型AMR Panel的结果未提供给患者护理团队，该研究的管理部分仅限于模拟。尽管未知医生会如何回应AMR Panel提供的信息，尤其是在常规工作时间之外，但可以合理地得出结论，一些患者本可以从更适当的抗菌治疗升级或降级中受益。

总之，这项对原型AMR Panel的前瞻性评估发现，该检测能预测大肠杆菌和肺炎克雷伯菌对许多常用抗菌药物的耐药性。一项模拟管理调查发现，该检测的结果本可以导致许多患者更快地升级和降级抗菌治疗。对该Panel优化版本的额外评估是必要的。

ACKNOWLEDGMENTS

这项工作由生物梅里埃公司资助（RCA 033-02-01）。

资助方参与了研究设计、数据分析以及手稿的撰写和编辑。