2024-2025流感季H5亚型RT-qPCR检测方法的验证与极低流行率分析

《Journal of Clinical Microbiology》：Validation of H5 influenza virus subtyping RT-qPCR assay and low prevalence of H5 detection in 2024–2025 influenza virus season

本刊推荐：本研究成功验证了一种用于鼻咽、鼻腔及结膜拭子样本的定性多重RT-qPCR H5流感病毒分型检测方法，检测限达250拷贝/毫升。通过对2024-2025流感季740份甲型流感病毒阳性样本进行回顾性及前瞻性检测，均未发现H5阳性病例，为当前H5N1禽流感在人群中的极低流行率提供了重要实验室证据，显著提升了临床大流行防范能力。

　　

ABSTRACT

H5N1流感病毒在野生鸟类和家畜中的持续爆发已在北美导致超过70例人畜共患感染病例，其中包括2例死亡。美国疾病控制与预防中心（CDC）建议对所有住院的甲型流感病毒（Influenza A virus）感染病例进行快速H5亚型分型，以便及时启动抗病毒治疗、感染预防和实施公共卫生措施以控制传播。为满足这些需求，我们开发了一种定性多重逆转录实时定量PCR（RT-qPCR）检测方法，用于对鼻、鼻咽和结膜标本中的H5流感病毒进行亚型分型，其检测限（Limit of Detection, LOD）为250拷贝/毫升。未观察到与其他常见呼吸道病毒（包括季节性H3N2和H1N1甲型流感病毒）的交叉反应。我们回顾性地对华盛顿大学实验室在2024年3月至2025年2月期间处理的590份Ct值小于31的甲型流感病毒阳性临床标本进行了亚型分型，其中包括2024-2025年流感季节收集的512份标本，未检测到H5阳性。临床实施后，我们在2025年2月至4月期间进行了150项临床要求的H5亚型分型检测，再次未检测到阳性。这项工作增强了临床大流行防范活动，并凸显了2024-2025年呼吸道季节H5N1流感病毒的流行率极低。

IMPORTANCE

截至2025年7月，H5N1流感病毒在美国的传播已导致近2亿只鸟类被扑杀，感染了17个州的牛群，并导致70例人类感染。H5流感病毒的快速PCR分型对于告知医院感染预防和公共卫生部门以遏制病毒传播至关重要。在此，我们报告了一种用于鼻咽、鼻腔和结膜拭子标本的定性多重H5亚型分型RT-qPCR检测方法的设计、验证和临床实施。此外，我们提供了迄今为止美国报道的最大规模的甲型流感病毒阳性标本H5亚型分型研究。在华盛顿州西雅图一个大型学术医疗系统中，从2024年3月到2025年4月期间收集的740份确诊甲型流感病毒感染患者的样本中，未检测到H5感染。

INTRODUCTION

自2021年以来，H5N1流感病毒一直在北美鸟类中持续传播。自2023年底以来，谱系2.3.4.4b H5N1甲型流感病毒的持续爆发已在美国的奶牛场和家禽场传播。目前，谱系2.3.4.4b内的两种基因型同时共循环：基因型B3.13，已证明在牛群中具有持续传播能力；以及基因型D1.1，在野生鸟类种群中传播，并已多次引入牲畜，包括家禽和奶牛。

两种基因型的人类感染均已被检测到，首例与疫情相关的病例于2024年4月被发现。迄今为止，北美已报告超过70例病例。虽然大多数病例无需住院治疗，但已报告了三例危重病例，包括路易斯安那州和墨西哥杜兰戈州的死亡病例。结膜炎是最常报告的症状。接触受感染的家畜是一个重要的风险因素，农场工人受到的影响尤为严重。在一项对H5N1感染农场奶业工人的血清学调查中，7%的人有近期感染H5亚型流感病毒的证据，表明该人群的感染流行率可能远高于已认知的水平。

及时识别H5N1流感病毒感染对于提供适当的医疗护理和遏制病毒进一步传播是必要的。CDC建议所有住院的甲型流感病毒感染患者应在入院后24小时内进行亚型分型——尤其是危重患者。由于H5N1流感病毒可导致严重疾病，且流行毒株仍对抗病毒药物敏感，因此对有症状的疑似H5N1流感病毒感染患者使用奥司他韦（oseltamivir）进行治疗是必要的。此外，建议采取空气预防措施和患者隔离以进行感染控制。

除了指导临床管理外，H5N1的分子诊断也改善了流感监测。尽管已努力加强对不可分型流感的监测，但目前的监测基础设施主要集中在监测具有已知接触受感染动物流行病学关联的病例，有可能导致无明确风险因素的病例未被发现。这种模式在以前的爆发中曾发生过，例如SARS-CoV-2。为了对所有流感病例中的H5N1感染进行无偏倚监测，需要与卫生系统整合。为了增加检测能力，CDC已发出呼吁，要求开发和实施用于检测H5亚型流感病毒的实验室开发测试（Laboratory-Developed Tests, LDTs）。

在此，我们报告了我们验证的一种用于鼻咽、鼻腔和结膜拭子中H5流感病毒亚型分型的定性多重RT-qPCR检测方法。我们使用该检测方法测试了2024年3月至2025年4月期间由华盛顿大学实验室处理的740份甲型流感病毒阳性标本，迄今为止未检测到H5流感病毒病例。

MATERIALS AND METHODS

临床标本和相关元数据

使用来自UW病毒学实验室的剩余去标识化鼻咽拭子、鼻腔拭子和结膜拭子进行验证。通过测试从UW Medicine获得的、采集日期为2024年3月或之后的剩余甲型流感病毒阳性呼吸道标本进行回顾性亚型分型。这些日期是根据美国报告首例人类H5N1感染的日期选择的。可用样本先前已为基因组监测而收集，且Ct值小于31。在UW Medicine进行检测验证和实施后，从实验室信息系统中获取检测结果和元数据。本研究经UW机构审查委员会批准，并获豁免知情同意。

H5 RNA模板

由于在初始检测验证期间不易获得含有H5N1流感病毒的临床标本，我们采用了三种替代的H5 RNA来源：两组合成RNA模板和一组从动物标本中提取的H5阳性RNA样本。第一组合成RNA是体外转录的，称为“IVT RNA模板”。H5 RNA是从一个包含谱系2.3.4.4b H5N1病毒毒株A/white-tailed eagle/Hokkaido/20220322001/2022的HA编码序列的gBlock转录而来。M RNA的制备如前所述。第二组合成RNA从美国国家标准与技术研究院（NIST）获得，为H5N1（禽流感）合成RNA片段（研究级测试材料10263）。NIST RNA组包括编码谱系2.3.4.4b H5N1病毒毒株A/American Wigeon/South Carolina/22/2021的HA、M和NA基因的合成RNA，背景为5 ng/μL Jurkat细胞RNA。

从华盛顿州立大学动物疾病诊断实验室获得了真实的H5N1阳性RNA样本（n = 7）。这些样本先前从各种动物源标本（包括哺乳动物呼吸道拭子、哺乳动物组织、散装牛奶以及禽类口咽/泄殖腔拭子）中提取。所有样本均经先前的RT-qPCR确认为甲型流感病毒阳性，并经先前的全基因组测序确认为含有H5N1 RNA。

灭活的H5N1病毒

使用代表B3.13和D1.1基因型的灭活H5N1病毒进行了额外验证。对于基因型B3.13，从BEI Resources获得了灭活的H5N1参考材料（NR-59886），其中包含经过组织培养适应的毒株A/bovine/Ohio/B24OSU-439/2024和经伽马射线灭活的细胞裂解物。

对于基因型D1.1，从CDC获得了H5N1流感病毒分离株A/Washington/239/2024，进行了传代并灭活。在传代前，将3.5 × 10⁶个MDCK细胞接种在T75培养瓶中，使用生长培养基（含有Earle's盐的MEM和2 mM glutaMAX，补充有10%体积/体积的热灭活胎牛血清（FBS）、1%体积/体积的青霉素-链霉素（Pen-Strep）和1%体积/体积的非必需氨基酸（NEAA）），并孵育过夜。第二天，将病毒储备液在感染培养基（含有Earle's盐的MEM和2 mM glutaMAX、0.3%重量/体积的牛血清白蛋白（BSA）、1%体积/体积的青霉素-链霉素、1%体积/体积的非必需氨基酸和0.4 μg/mL TPCK处理的胰蛋白酶）中稀释制备病毒接种物。用普通MEM洗涤细胞以去除FBS，然后以基于储备液滴度（2.0 × 10⁸ TCID₅₀/mL）的0.01感染复数（MOI）在2 mL感染培养基中感染细胞。允许病毒吸附1小时，每20分钟重新分布一次接种物。吸附后，加入8 mL感染培养基，最终体积为10 mL。在感染后2天，超过90%的细胞单层出现细胞病变效应（CPE）时，收集上清液，通过500 × g离心10分钟与细胞碎片分离，并分装。通过TCID₅₀试验在MDCK细胞上对病毒储备液进行滴定，每个稀释度使用八个重复，并在感染后5天评分CPE。使用Spearman-Karber法计算TCID₅₀/mL估计值。

使用经华盛顿大学机构生物安全委员会批准的验证程序对病毒进行灭活。简言之，将病毒上清液在400 μL等分试样中于65°C热处理30分钟。对于每个等分试样，通过TCID₅₀试验测试100 μL灭活材料来确认灭活。每次测定均包括阳性对照（未热处理）和阴性对照（无病毒）。

RNA提取

使用Roche MagNA Pure 96仪器和Viral NA Small Volume Kit从临床标本中提取RNA。对于每个样本，使用200 μL标本作为输入，并在50 μL洗脱缓冲液中洗脱RNA。裂解缓冲液中包含一个外源RNA模板作为内部对照。

逆转录定量PCR反应条件

使用AgPath-ID One-Step RT-PCR Kit进行多重逆转录定量PCR（RT-qPCR）。对于每个反应，将5 μL提取的RNA加入到含有12.5 μL AgPath Master Mix、1 μL AgPath Enzyme以及指定浓度的引物和探针的反应混合物中；总反应体积为25 μL。反应在ABI 7500 Thermocyclers上运行。循环参数为：45°C 10分钟，95°C 10分钟，然后进行45个循环的95°C 15秒，接着60°C 45秒。对所有荧光团使用ROX归一化和自动基线。H5靶标（FAM）的阈值设为0.18，甲型流感病毒靶标（VIC）设为0.16，内部对照靶标（Cy5）设为0.1。Ct值小于45被认为是阳性。

逆转录微滴式数字PCR反应条件

使用BioRad One-Step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes进行逆转录微滴式数字PCR（RT-ddPCR），使用来自RT-qPCR检测的H5-2和M引物和探针。每个25 μL反应通过将5 μL提取的RNA与20 μL主混合物混合制备，主混合物包含6.25 μL Super Mix、2.5 μL RT酶、1.25 μL DTT、最终浓度为900 nM的H5-2引物、每种最终浓度为450 nM的M引物以及最终浓度为250 nM的探针。使用BioRad Automated Droplet Generator，将总反应混合物中的20 μL用于微滴生成，并将40 μL微滴悬浮液转移至96孔板。反应在BioRad C1000 Touch热循环仪上运行，使用以下条件：50°C 60分钟，95°C 10分钟，40个循环的95°C 30秒，接着60°C 1分钟，以及98°C 10分钟。在BioRad QX600 Digital Droplet Reader上使用绝对定量方法测量荧光。阳性微滴超过50%的样本落在定量范围之外，被排除在分析之外。

通过上述描述的RT-ddPCR测量IVT RNA和NIST RNA模板的绝对浓度。在按照上述描述进行RNA提取后，测量无单位的BEI H5N1参考材料和灭活H5N1病毒的绝对拷贝数。

引物和探针序列的计算分析

为了评估所选寡核苷酸与当代北美病毒之间的相似性，进行了计算分析。从NCBI下载了2024年1月1日至2025年1月31日期间在北美收集的所有H5 HA序列。使用MAFFT对序列进行比对。注释结合区域，并独立分析每个引物或探针。排除在结合位点一个或多个核苷酸缺乏覆盖的序列。计算错配数量；保守地将模糊核苷酸视为错配。

检测限

通过将灭活的H5N1病毒（A/Washington/239/2024）掺入混合的、流感病毒阴性的鼻咽拭子标本中来评估包括提取在内的完整检测方法的检测限（LOD）。使用范围从1:10²到1:10⁸的10倍稀释系列进行初始LOD估计，每个浓度有四个重复提取RNA。制备了额外的重复用于与完整的CDC检测方案进行比较。使用围绕初始限值的4倍系列稀释来确认LOD，每个浓度有20个重复提取RNA。报告95% LOD（LOD₉₅）为至少19个重复产生阳性结果的最低浓度。使用IVT H5（储备液通过使用H5-2引物和探针的RT-ddPCR测定为1.07 × 10⁶拷贝/μL）和NIST M（通过使用M引物和探针的RT-ddPCR测定为1.47 × 10⁵拷贝/μL）RNA模板测定多重RT-qPCR反应的绝对LOD。将每种RNA模板的10微升混合并在80 μL AE缓冲液中稀释。将该储备液在AE缓冲液中按10倍稀释进行初始LOD测定，并围绕初始LOD进行2倍稀释进行确认。测试每个浓度的20个重复，报告95% LOD为至少19个重复产生阳性结果的最低浓度。

检测灵敏度和基质兼容性

使用从动物标本中提取的H5N1阳性RNA样本（n = 7）以及掺有灭活B3.13病毒（n = 69）或D1.1病毒（n = 160）的模拟H5N1阳性标本来评估检测灵敏度。为了制备含有基因型B3.13病毒的低阳性标本，将灭活的A/bovine/Ohio/B24OSU-439/2024病毒（从BEI接收，无单位）以体积比1:50,000添加到鼻腔和结膜标本中，以1:10,000添加到鼻咽标本中。体积至少为220 μL的标本单独测试，而体积较小的标本则合并并等分。总共制备了29份鼻腔标本（20份单独，9份合并）；20份结膜标本（7份单独，13份合并）；以及20份鼻咽标本（20份单独，0份合并）。

为了制备含有基因型D1.1病毒的H5N1阳性标本，将灭活的A/Washington/239/2024病毒添加到混合的鼻咽、鼻腔或结膜标本中或AE缓冲液中。用每种基质制备三个水平的H5N1阳性标本，目标为低（400 TCID₅₀/mL）、中（20,000 TCID₅₀/mL）和高（1,000,000 TCID₅₀/mL）滴度的H5N1病毒。制备了20个重复的低浓度标本，以及10个重复的中等和高浓度标本。使用Clopper-Pearson精确法计算一致性度量（Measures of Agreement）的95%置信区间（95% CIs）。

检测特异性

使用三种类型的H5阴性标本来评估特异性：鼻咽拭子（n = 20）、鼻腔拭子（n = 29）和结膜拭子（n = 18）。通过Cepheid Xpert Xpress CoV-2/Flu/RSV plus或Hologic Panther Fusion Flu A/B/RSV检测确认这些呼吸道标本为甲型/乙型流感病毒阴性。结膜拭子是为HSV和/或VZV检测而收集的。使用通过临床检测（通过Cepheid或Hologic呼吸道panel检测或全基因组测序）已知含有常见呼吸道病毒的标本进一步评估特异性。这些包括甲型流感病毒亚型H3N2（n = 21）和H1N1（n = 17）、乙型流感病毒（n = 3）、呼吸道合胞病毒（n = 7）和SARS-CoV-2（n = 10）。

与CDC甲型流感/H5亚型分型试剂盒的比较

由于只有一种RT-qPCR检测方法经FDA批准用于H5N1检测，我们将我们的多重RT-qPCR检测方法与CDC的Influenza A/H5 Subtyping Kit（版本4, #FluIVD03-11）进行了比较。为了评估包括提取在内的完整检测方法的相对性能，制备了含有掺入混合鼻咽标本的灭活A/Washington/239/2024病毒的重复样本。按照CDC H5亚型分型试剂盒方案提取RNA，该方案与我们的多重检测中使用的提取方案不同。使用Roche MagNA Pure 96仪器和Viral NA Small Volume Kit，将100 μL标本与350 μL External Lysis Buffer混合，并使用整个体积（450 μL）作为输入。在100 μL洗脱缓冲液中洗脱RNA。根据制造商方案，使用Invitrogen SuperScript III Platinum One-Step Quantitative RT-PCR System在ABI 7500 FAST热循环仪上运行CDC RT-qPCR反应。对于CDC试剂盒中的每个单重反应，将5 μL核酸模板加入到20 μL反应混合物中，该混合物包含12.5 μL 2× PCR主混合物、5.5 μL水、0.5 μL酶和1.5 μL根据试剂盒方案制备的组合引物/探针混合物；总体积为25 μL。

为了比较分离RNA上RT-qPCR反应的性能，在同一组分离的RNA模板上并行运行CDC H5亚型分型反应和新型多重反应。对于IVT RNA和NIST RNA模板，通过以1:1的体积比组合H5和M合成RNA，并在AE缓冲液中连续稀释模板混合物来制备10倍稀释系列。将灭活的A/bovine/Ohio/B24OSU-439/2024病毒在PBS中初始稀释1:100，并从该储备液中在PBS中制备10倍稀释系列，并如上所述提取RNA。在稀释（以及对于灭活病毒，在提取后）后，通过RT-ddPCR测定每种模板储备液的绝对拷贝数。按照每种检测的描述运行RT-qPCR反应。

RESULTS

引物和探针序列的设计和计算分析

设计了一个三通道多重RT-qPCR反应，用于定性检测H5亚型流感病毒。主要靶标是H5流感病毒的HA基因。为了降低因病毒进化或试剂失效导致的假阴性风险，选择了靶向该基因两个非重叠区域的引物和探针。一个H5靶标（H5-1）使用由Shu等人设计的寡核苷酸，产生一个从HA CDS位置1,481到1,629的149 bp产物。另一个H5靶标（H5-2）使用由Sahoo等人设计并改编自香港卫生防护中心最初设计的序列的寡核苷酸。该靶标产生一个从HA CDS位置1,101到1,244的144 bp产物。作为泛甲型流感病毒对照，靶向了甲型流感病毒M基因的高度保守区域，使用了由CDC国家免疫和呼吸道疾病中心设计的引物和探针。包含了靶向编码海洋物种Podocornye carnea的TMP1基因的外源RNA模板的寡核苷酸作为内部对照。

由于检测方法开发开始时验证材料非常有限，引物和探针被设计为与2009年的灭活H5N1病毒参考材料（BEI Resources NR-59421）结合，该材料具有 divergent 的HA序列。因此，基因型B3.13病毒在H5探针1中有两个错配，在H5探针2中没有错配；而基因型D1.1病毒在H5探针1中有三个错配，在H5探针2中有一个错配。尽管存在这些序列差异，探针仍能正常功能性地检测当代模板。IVT RNA靶标中存在相同的错配，并且可以被任一探针单独可靠地检测到。

通过计算分析评估了寡核苷酸序列与当代北美H5流感病毒序列的相似性。从NCBI GenBank检索到2024年1月1日至2025年1月31日期间在北美收集的总共2,788条H5 HA序列。在六个靶向H5 HA的寡核苷酸中，有五个与近期序列高度匹配，99%的序列中有两个或更少的错配。一个寡核苷酸（H5探针1）在92%的近期H5序列中显示两个错配，在8%的序列中显示三个或更多错配——主要是基因型D1.1毒株。

通过Ct值估算模板拷贝数

为了确定RT-qPCR反应产生的Ct值与模板分子绝对拷贝数之间的关系，对从灭活H5N1病毒A/Washington/239/2024提取的RNA稀释系列进行了并行RT-qPCR和RT-ddPCR测试。1:10⁴到1:10⁶之间的稀释产生了定量范围内的RT-ddPCR结果，为比较提供了三个数量级的范围。观察到H5靶标（R² = 0.99）和M靶标（R² = 0.98）均存在强线性关系。虽然临床检测设计为定性而非定量，但可以使用拟合这些数据的线性模型根据Ct值估算多重RT-qPCR反应中模板的绝对拷贝数。

检测限

使用在AE缓冲液中的H5和M IVT RNA模板的2倍系列稀释测量了RT-qPCR反应的绝对LOD。通过识别至少19个重复被检测到的最低浓度来测量95% LOD（LOD₉₅）。H5靶标的LOD₉₅为每个反应4.7个拷贝，M靶标为每个反应36.3个拷贝。

通过使用从提取开始的独立重复，测量了包括提取在内的完整检测方法的LOD，使用掺入混合鼻咽拭子标本的灭活H5N1病毒（A/Washington/239/2024）。H5靶标的LOD₉₅为24 TCID₅₀/mL，M靶标的LOD₉₅为390 TCID₅₀/mL。基于观察到的Ct值，我们估计鼻咽标本中H5靶标的绝对LOD₉₅为每个反应5.0个拷贝（250拷贝/mL），M靶标为每个反应12.3个拷贝（615拷贝/mL），这与使用合成RNA模板在缓冲液中测量的绝对限度非常接近。该检测在5个数量级的输入范围内表现出线性性能，H5靶标的R²值为0.998，M靶标为0.996。H5靶标的效率为99.0%，M靶标为104.5%。

灵敏度和基质兼容性

使用掺有灭活H5N1病毒的临床标本，在一系列病毒浓度、基质和基因型中评估了灵敏度。对于基因型B3.13，我们通过将灭活的A/bovine/Ohio/B24OSU-439/2024病毒以1:50,000的体积比添加到流感病毒阴性的鼻腔和结膜拭子标本中，以及以1:10,000添加到鼻咽标本中，生成了低浓度H5阳性样本。提取和RT-qPCR测试后，鼻咽标本的平均H5 Ct值为34.7（估计每个反应50.5个拷贝），鼻腔标本为36.7（估计每个反应16.7个拷贝），结膜标本为35.9（估计每个反应22.0个拷贝）。所有20份鼻咽拭子标本和所有29份鼻腔拭子标本的H5靶标检测均为阳性，显示100%阳性一致性。在结膜拭子中，20份样本中有19份H5靶标检测为阳性，显示95%阳性一致性。

对于M靶标，所有20份鼻咽拭子标本检测均为阳性，平均Ct值为34.6（估计每个反应48.7个拷贝），显示100%阳性一致性。29份鼻腔拭子标本中有25份扩增了M靶标，平均Ct值为37.3（估计每个反应6.7个拷贝），显示86%阳性一致性。20份结膜拭子标本中有18份扩增了M靶标，平均Ct值为37.2（估计每个反应7.2个拷贝），显示90%阳性一致性。

对于基因型D1.1，将三种基质和AE缓冲液掺入灭活H5N1病毒（A/Washington/239/2024），以创建低、中、高滴度的模拟阳性标本。H5靶标的平均Ct值在低浓度标本中为33.7，中浓度标本为28.2，高浓度标本为22.2（估计分别为每个反应100、4,500和284,000个拷贝）。对于M靶标，平均Ct值分别为36.3、30.7和24.8（估计分别为每个反应15、850和64,000个拷贝）。所有标本的H5靶标检测均为阳性，在所有基质和病毒浓度下显示100%阳性一致性。对于M靶标，一份低阳性鼻咽拭子标本假阴性，显示95%阳性一致性；所有其他基质