QIAstat-Dx胃肠道检测试剂盒2对艰难梭菌检测性能的多平台评估与比较研究

《Journal of Clinical Microbiology》：Performance evaluation of the QIAstat-Dx gastrointestinal panel 2 for the detection of Clostridioides difficile against multiple commercial assays

本文评估了QIAstat-Dx胃肠道检测试剂盒2（GIP 2）对艰难梭菌（Clostridioides difficile）的检测性能，并与四种商业化核酸扩增检测（NAATs）及免疫学方法进行比较。结果表明，QIAstat-Dx GIP 2具有优异的阳性符合率（PPA）和阴性符合率（NPA），检测性能与其他主流NAATs相当，且其短时操作流程（<1.5小时）为实验室粪便检测提供了高效解决方案。

　　

摘要

急性胃肠炎（AGE）可由多种病原体引起，包括细菌、病毒和寄生虫，其临床症状常有重叠。社区获得性胃肠炎由多种病原体引起，而医疗保健相关性胃肠炎主要由艰难梭菌（Clostridioides difficile）导致。当前的诊断方法包括单独使用艰难梭菌核酸扩增检测（NAATs）或将其与艰难梭菌抗原和毒素的酶免疫分析（EIA）结合使用。本研究评估了使用QIAstat-Dx多重胃肠道检测试剂盒2（GIP 2）从290份临床样本中检测艰难梭菌的分析性能，并与四种市售NAATs（Cepheid Xpert艰难梭菌检测、BD MAX Cdiff检测、Verigene CDF检测和BioFire GI检测试剂盒）以及艰难梭菌免疫分析进行了比较。计算了研究中所有检测方法的阳性符合率（PPA）和阴性符合率（NPA）。与其他NAATs相比，所有分子检测方法均显示出高于85%的PPA和高于96%的NPA。QIAstat-Dx GIP 2的性能与其他NAATs相当，与Cepheid Xpert艰难梭菌检测、BD MAX Cdiff检测、Verigene CDF检测和BioFire GI检测试剂盒相比，其PPA分别为95.0%、88.5%、98.1%和93.7%，NPA分别为98.2%、96.9%、96.6%和99.1%。总体而言，QIAstat-Dx GIP 2检测准确，与其它市售方法相当，且其短时操作流程为实验室粪便检测提供了高效的工作流程。

重要性

艰难梭菌感染（CDI）范围从腹泻到危及生命的伪膜性结肠炎。临床标准包括24小时内三次或更多次稀便，而诊断检测包括单独的核酸测试或与艰难梭菌抗原和毒素的酶免疫分析结合使用。本研究评估了使用QIAstat-Dx多重胃肠道检测试剂盒从临床样本中检测艰难梭菌的分析性能，并与四种商业检测方法（Cepheid Xpert艰难梭菌检测、BD MAX Cdiff检测、Verigene CDF检测和BioFire GI检测试剂盒）以及一种艰难梭菌免疫分析进行了比较。BioFire GI检测试剂盒具有最高的阳性符合率（90–100%），其次是QIAstat-Dx（88–98%）、BD MAX（87–98%）和Xpert检测（86–96%）。QIAstat-Dx与所有核酸测试均显示出较高的阳性和阴性一致性。QIAstat-Dx GIP 2的短时操作流程也提供了简化的工作流程。

引言

急性胃肠炎（AGE）的特征是腹泻、发烧、腹痛、食欲不振、恶心和结肠炎等症状。美国疾病控制与预防中心（CDC）估计美国每年有近2亿例AGE病例。AGE由多种病原体引起，包括寄生虫、细菌和病毒，通常具有重叠的临床表现，这使得诊断具有挑战性。社区获得性胃肠炎由多种病原体引起，而医疗保健相关性胃肠炎则由艰难梭菌引起。

艰难梭菌是一种产毒素、厌氧、革兰氏阳性细菌，每年导致约453,000例病例和29,300例相关死亡。艰难梭菌感染（CDI）的经济负担巨大，超额医疗费用估计为48亿美元。CDI范围从腹泻到危及生命的伪膜性结肠炎。在健康成人中，结肠细菌菌群通常赋予对艰难梭菌定植的抵抗力。然而，正常结肠菌群的破坏，最常见的是由于抗生素暴露，会损害这种抵抗力。艰难梭菌的主要毒力因子是细胞毒素B，编码毒素A（tcdA，一种肠毒素）和毒素B（tcdB）的基因位于致病性基因座（PaLoc）内。

CDI的临床标准包括24小时内三次或更多次稀便。检测产毒性艰难梭菌的金标准是通过产毒粪便培养或细胞毒性中和试验。产毒粪便培养和细胞毒性中和试验虽然灵敏，但耗时且在大多数临床实验室中不切实际用于常规使用。当前的诊断方法利用艰难梭菌毒素基因（tcdA和/或tcdB）核酸扩增检测（NAATs）单独或与艰难梭菌谷氨酸脱氢酶（GDH）抗原和毒素（TcdA和TcdB）的酶免疫分析（EIA）结合使用。艰难梭菌也是市售胃肠道病原体检测试剂盒（GPPs）的目标之一，例如QIAstat-Dx胃肠道检测试剂盒2和Luminex xTAG GPP，它们可同时检测多种病原体以评估AGE。尽管NAATs具有高灵敏度和快速性，但不当使用可能由于检测到无症状携带者而导致CDI的过度诊断。因此，仅在临床指征时进行CDI检测对于指导临床护理的及时治疗决策非常重要。

本研究评估了使用研究用途（RUO）版本的QIAstat-Dx GIP 2从临床样本中检测艰难梭菌目标的分析性能，并与四种市售检测方法进行比较，包括Cepheid Xpert艰难梭菌检测、BD MAX Cdiff检测、Verigene CDF检测和BioFire FilmArray GI检测试剂盒。

材料与方法

临床样本

粪便样本在威斯康星医学院（密尔沃基，威斯康星州）入组。如果符合以下标准，则入组提交至实验室进行标准护理（SOC）艰难梭菌检测的所有年龄受试者的残留粪便：足够体积（≥8 mL或≥6 g）、未保存且未成形（液体或软便）（布里斯托大便分类法评分5-7）置于无菌容器中，并且能够在收集后24小时内入组。成形粪便被拒绝用于艰难梭菌检测。根据机构政策，如果样本在14天内艰难梭菌检测呈阳性，或在7天内检测呈阴性，则拒绝重复进行SOC检测，并被排除在研究之外。

威斯康星医学院机构审查委员会（IRB）获得了使用残留样本并从其医疗记录中收集受试者信息的知情同意要求的豁免（IRB：PRO00046636）。在样本收集时收集人口统计数据，包括临床医生下令的（SOC）艰难梭菌检测（Cepheid Xpert）结果、受试者性别和受试者年龄类别。符合研究纳入标准的粪便由诚实经纪人进行去标识化处理。使用布里斯托大便分类法对粪便稠度进行评分，然后将样本分成两个容器，一个无菌容器（未保存粪便）用于Cepheid Xpert艰难梭菌检测（SOC测试）、Verigene CDF和BD MAX艰难梭菌检测，另一个容器装有Meridian Para-Pak C&S Cary-Blair转运培养基中的粪便（保存粪便）用于QIAstat-Dx检测和FilmArray GI检测试剂盒测试。所有样本在收到后储存于2–8°C，入组样本在样本收集后2天内进行测试。另取一份0.5 mL等分试样冷冻（-70°C）并在干冰上运往西班牙巴塞罗那的STAT-Dx Life（QIAGEN公司）进行PCR和双向测序分析。

为补充研究，从独立实验室获取了17份先前阳性（Xpert）的未保存冷冻粪便样本，并通过所有比较检测方法进行测试。还获得了这部分样本的患者年龄和性别人口统计数据。本研究总共评估了290份残留临床粪便样本（273份前瞻性样本和17份回顾性样本）。

QIAstat-Dx GIP 2检测

QIAstat-Dx GIP 2是一种多重核酸测试，旨在检测多达22种（24个目标，包括stx1/2、大肠杆菌O157血清群）细菌、病毒和寄生虫病原体（STAT-Dx Life）。在本研究期间，使用了研究用途（RUO）版本的QIAstat-Dx GIP 2来评估艰难梭菌目标（检测艰难梭菌毒素A和B基因目标，分别为tcdA和tcdB）。测试根据制造商的说明进行。简而言之，将200 μL保存在Cary-Blair转运培养基中的粪便加载到QIAstat-Dx艰难梭菌RUO检测盒中，然后使用模块化QIAstat-Dx分析仪1.0进行处理。检测盒包含样本制备、多重RT实时PCR和内部对照（IC）所需的所有试剂。IC的阳性信号表示检测结果有效，而阴性结果缺乏信号则使检测无效。总检测运行时间小于1.5小时，检测设置时间为2分钟。

BioFire FilmArray胃肠道（GI）检测试剂盒

BioFire GI检测试剂盒是一种多重核酸测试，旨在检测22种与胃肠炎相关的最常见病原体，包括5种病毒、4种寄生虫和13种细菌（BioMerieux，法国马西莱图瓦勒）。BioFire GI检测试剂盒检测艰难梭菌基因目标tcdA和tcdB。测试根据制造商的说明进行。将200 μL保存在Cary-Blair转运培养基中的粪便等分试样与专用缓冲液混合，加载到一次性使用的袋中，并在BIOFIRE Torch系统上运行。检测设置时间大约需要2分钟的手动操作时间，运行时间约为1小时。

Cepheid Xpert艰难梭菌检测

Cepheid Xpert艰难梭菌检测（Cepheid，森尼维尔，加利福尼亚州）是一种快速、自动化的测试，用于定性检测疑似CDI患者的未成形（未保存）粪便拭子中的产毒性艰难梭菌。该检测目标为tcdB，并在Cepheid GeneXpert Dx系统（Cepheid）上进行。总检测运行时间约为43分钟。检测设置时间约为5分钟（根据实验室经验）。

BD MAX Cdiff检测

BD MAX艰难梭菌检测（BD，富兰克林湖，新泽西州）是一种实时聚合酶链反应（PCR）测试，旨在检测未保存的人体液体或软便样本中的艰难梭菌tcdB。该检测使用PCR扩增tcdB，并采用荧光靶标特异性杂交探针检测扩增的DNA。进行测试时，将一次性10 μL接种环浸入粪便材料中，并将样本分散到BD MAX Cdiff样本缓冲液管中。将样本缓冲液管、BD MAX Cdiff单元化试剂条和BD PCR盒加载到BD MAX系统上，该系统自动进行样本制备，包括靶标裂解、DNA提取和浓缩、试剂复水，以及使用实时PCR进行靶核酸扩增和检测。根据制造商网站，总检测运行时间为2小时，检测设置时间为1分钟。

Verigene艰难梭菌核酸测试（Verigene CDF测试）

Verigene艰难梭菌（Nanosphere，诺斯布鲁克，伊利诺伊州）核酸测试是一种多重、定性检测方法，用于快速检测三个艰难梭菌目标：tcdA、tcdB和tcdC。如果检测到tcdA或tcdB，该检测将报告为艰难梭菌检测到；tcdC是一个可选目标，用于流行病学目的以评估PCR核糖体型027菌株的存在。根据测试方案处理并稀释来自患者的未成形（未保存）粪便拭子，然后应用于Verigene测试盒，随后将其放入Verigene系统。根据制造商网站，总检测运行时间<2小时，检测设置时间<5分钟。

艰难梭菌毒素B基因（tcdB）双向测序

本研究中对任何检测呈阳性的69份临床样本（总共71份阳性）进行了tcdB PCR分析，所有PCR阳性样本均进行了tcdB双向测序。通过PCR扩增毒素B基因tcdB的一个片段，用于双向测序。简而言之，使用Griffiths等人描述的方法扩增并测序tcdB。使用QIAcube系统（QIAGEN N.V.，德国希尔登）和采用QIAamp Cador Pathogen Mini Kit（QIAGEN，目录号54106）试剂的定制方案对所有样本进行核酸提取。每次运行均包含一个阳性对照和三个阴性对照（AVE缓冲液（166020921；QIAGEN）），分别用于确认扩增和没有交叉污染。所有PCR运行均使用QuantStudio 5实时PCR系统和QuantStudio Design and Analysis软件版本1.4（Thermo Scientific）进行。使用D1000 ScreenTape（Agilent Technologies，Ref: 5067-5582）和D1000试剂（Agilent Technologies，Ref: 5067-5583）通过TapeStation分析所有结果。在TapeStation中显示预期条带大小为688 bp的所有PCR产物通过ExoSAP-IT Express PCR产物纯化试剂（Thermofisher；Ref: 75001.40 .UL）进行纯化，通过Qubit dsDNA高灵敏度检测试剂盒（Thermofisher；Ref: Q32854）进行定量，并标准化至25–100 ng/μL的浓度。使用BigDye Terminator v3.1循环测序试剂盒（Thermofisher；Ref: 4337455）组装桑格测序反应，使用用于扩增的正向和反向引物（5 μM），并在3730 DNA分析仪或3730xl DNA分析仪测序仪（Applied Biosystems）上进行。从PCR产物纯化到桑格测序的所有步骤均由巴塞罗那大学科技中心（CCiTUB）的基因组学部门执行。使用Geneious软件v.2023.2分析序列，那些显示至少200个可接受质量碱基的序列（定义为总碱基中至少90%的PHRED质量得分≥20，且总碱基中模糊核苷酸少于5%）在BLAST上针对美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库的非冗余核苷酸集合（Nr/nt）数据库运行，使用标准BLASTn搜索参数。获得的最佳BLAST命中，其与参考序列相比具有至少95%的查询覆盖率和95%的同一性，且BLAST e值低于1 × 10^?30，用于确认序列对应于艰难梭菌tcdB基因。这些序列也经过目视检查，并在可能的情况下，根据序列同源性，按照Shen等人描述的不同tcdB亚型进行分类。

C. DIFF QUIK CHEK complete检测

C. DIFF QUIK CHEK Complete测试（Techlab，布莱克斯堡，弗吉尼亚州）是一种快速膜EIA，用于在单个反应孔中同时检测艰难梭菌谷氨酸脱氢酶抗原和毒素A和B。根据制造商的说明测试粪便样本。有七份样本未进行毒素和GDH抗原测试。

数据分析和无效样本

对于双靶标检测，检测到tcdA和/或tcdB会导致艰难梭菌阳性结果，而仅靶向tcdB的检测则需要检测到tcdB才能获得艰难梭菌阳性结果（参见表1了解特定检测的艰难梭菌目标）。如果未获得有效结果，则在每个平台上重复测试一次。如果重复测试再次产生无效结果，则报告为“无效”。无效结果包括内部对照失败、不确定结果、“无结果”或系统错误（例如，检测平台机械故障）。按照制造商的说明，对显示错误信息指示用100 μL样本而非200 μL重复测试的QIAstat-Dx样本进行了相应操作。计算了研究中每种检测与其他检测相比的阳性符合率（PPA）和阴性符合率（NPA）。无效样本结果被排除在此分析之外。

表1 艰难梭菌检测特性

检测方法	检测类型 [n]a	艰难梭菌基因目标	检测设置时间b	运行时间b	样本体积
QIAstat-Dx GIP 2	多重检测试剂盒 [24]	tcdA; tcdB	2分钟	<1.5小时	200 μL
Cepheid Xpertc	艰难梭菌特异性 [1]	tcdB	5分钟	43分钟	拭子
BD MAX Cdiff检测	艰难梭菌特异性 [1]	tcdB	2分钟	2小时	10 μL
Verigene CDF测试	艰难梭菌特异性 [3]	tcdA; tcdB; tcdCd	<5分钟	2小时	拭子
BioFire GI检测试剂盒	多重检测试剂盒 [22]	tcdA; tcdB	2分钟	<1小时	200 μL

^a “多重”表示额外的细菌、病毒和/或寄生虫目标；[n] 每个检测的分析物数量。

^b 小时 (h), 分钟 (m)。

^c 标准护理 (SOC) 检测。

^d 区分tcdA和tcdB目标；tcdC仅用于流行病学目的。

结果

临床人口统计学

前瞻性收集的、提交至临床实验室进行SOC艰难梭菌检测的未保存粪便样本（n = 273）被纳入研究。记录了所有前瞻性入组受试者的患者性别、年龄和布里斯托大便评分。此外，还从入组受试者（17份先前艰难梭菌阳性（Xpert）样本）获得了人口统计数据（年龄和性别）。研究中入组的受试者略超过一半为女性（54%；n = 156/290），男性受试者占46%。受试者平均年龄为59岁（范围：17至≥89岁），中位年龄为62岁。本研究入组样本的布里斯托大便评分范围从5型（软便）到7型（完全液体）。7型粪便（n = 178）占研究中入组粪便样本的65.2%，其次是6型（23.1%；n = 63）和5型（11.7%；n = 32）。

检测性能

研究中入组的粪便样本（n = 273 前瞻性；n = 17 补充阳性样本）在五种NAATs上进行了评估：QIAstat-Dx GIP 2、Cepheid Xpert艰难梭菌检测、BD MAX Cdiff检测、Verigene CDF检测和BioFire FilmArray GI检测试剂盒（表1）。粪便样本还使用C. DIFF QUIK CHEK Complete艰难梭菌抗原和毒素EIA进行了测试。

在本研究期间，没有无效或失败的Cepheid Xpert艰难梭菌检测。五份BioFire样本（5/290；1.7%）由于仪器故障或仪器重启而无效，六份BD MAX样本（6/290；2.1%）产生不确定结果。二十份QIAstat-Dx样本（20/290；6.9%）由于仪器故障、“样本浓度过高”故障、无效运行（内部对照失败且至少一种分析物被检测到，其他分析物报告为“无效”）或其他运行故障而失败。十九份Verigene样本失败（19/290；6.6%），原因是背景高、内部对照失败、不确定结果或机械或检测盒问题。对无效样本进行单次重复测试后，BioFire和BD MAX检测均产生100%有效结果，只有两份样本在QIAstat-Dx和Verigene上仍然无效（总体无效率为0.7%）。

NAATs之间的一致性

在本研究中，有71份样本在至少一种NAAT上呈阳性。49份样本（49/290；16.9%）在所有五种NAATs上均呈阳性，另有七份样本在五种NAATs中的四种上呈阳性。BioFire GI检测试剂盒的阳性结果数量最多（n = 63），其次是QIAstat-Dx GIP 2（n = 61）和BD MAX Cdiff（n = 61），然后是Cepheid Xpert艰难梭菌检测（n = 60）、Verigene CDF（n = 53）以及艰难梭菌抗原（n = 48）和毒素（n = 19）检测（表2）。

计算了每种检测与其他检测作为比较方法的PPA和NPA（表2和表3）。表格包括每对比较的原始数据和符合率百分比。如果配对比较中一项测试的结果无效，则两项测试结果均被排除在分析之外（即，分母根据有效测试结果的数量而变化）。与其他NAATs相比，BioFire GI检测试剂盒具有最高的总体PPA（90–100% PPA），其次是QIAstat-Dx GIP 2（88–98% PPA）、BD MAX（PPA 87–98%）和Xpert艰难梭菌检测（86–96% PPA）（表2）。与其他NAATs相比，Verigene CDF的PPA范围为85%至86%（表2）。所有NAATs的NPA均大于96%（表3）。

表2 阳性符合率（PPA）^c,d

（n = 290，比较方法见列，测试方法见行，数值为阳性数/比较方法阳性数，粗体百分比为符合率）

（此处省略具体数值表格，摘要关键结果）

QIAstat-Dx GIP 2检测（保存粪便）与通过Cepheid Xpert艰难梭菌检测、BD MAX Cdiff检测和Verigene CDF检测测试的未保存粪便样本相比，分别显示出95.0%、88.5%、98.1%的PPA（表2）和98.2%、96.9%、96.6%的NPA（表3）。使用保存样本，QIAstat-Dx GIP 2与BioFire GI检测试剂盒相比显示出93.7%的PPA和99.1%的NPA（表2和表3）。

艰难梭菌毒素和抗原（Ag）评估

与NAATs检测艰难梭菌目标相比，艰难梭菌毒素和抗原（GDH）阳性样本的数量较少。在测试的样本中，19份艰难梭菌毒素阳性，48份GDH阳性。所有19份艰难梭菌毒素阳性样本在研究评估的五种NAATs中也均为艰难梭菌目标阳性。与NAATs检测艰难梭菌相比，GDH阳性样本的PPA范围为65%至76%（表2），而与NAATs相比，NPA为96–98%（表3）。研究中有三份粪便样本为GDH阳性、毒素阴性，并且所有五种NAATs的艰难梭菌毒素基因均为阴性。

双向测序和tcdB亚型分析

本研究中有71份样本在至少一种NAAT上呈阳性。对报告至少一种NAAT艰难梭菌阳性结果的69份临床样本进行了tcdB PCR分析，随后进行双向测序以对艰难梭菌毒素B基因进行亚型分析。有两份样本未进行PCR和测序测试；一份在五种NAATs中的四种上呈阳性（Xpert、QIAstat-Dx、BioFire和BDMax，但Verigene阴性），另一份仅在QIAstat-Dx上呈阳性。在通过PCR测试的69份样本中，11份为阴性（未通过PCR扩增出产物），1份样本未提供序列数据。6份tcdB PCR阴性样本仅通过BD MAX检测呈艰难梭菌阳性；两份样本通过两种NAATs呈阳性（一份BioFire和QIAstat阳性；一份Xpert和QIAstat阳性），一份通过三种NAATs呈阳性（Xpert、QIAstat和BioFire），两份通过所有五种NAATs呈艰难梭菌阳性。

其余57份样本通过PCR和测序分析为tcdB阳性（表4）。与双向测序确认的tcdB相比，BioFire的PPA最高（100%），其次是Cepheid Xpert（94.7%）、QIAstat-Dx（93.0%）、BD MAX（89.5%）和Verigene（87.7%）。主要亚型是tcdB1a（77%；n = 44/57），其次是tcdB2（15.8%；9/57）和tcdB4（3.5%；2/57）。3.5%（2/57）的测试样本无法确定亚型。

表4 与tcdB PCR和双向测序分析的一致性^a

检测方法	阳性数 (n = 57)	百分比 (%)
BioFire GI检测试剂盒	57	100.0%
Cepheid Xpert	54	94.7%
QIAstat-Dx GIP 2	53	93.0%
BD MAX Cdiff	51	89.5%
Verigene CDF	50	87.7%
艰难梭菌 Ag	42	73.7%
艰难梭菌 毒素	19	33.3%

^a 69份样本通过PCR测试；11份样本PCR阴性，1份PCR阳性样本未产生测序数据。

讨论

NAATs用于直接从临床粪便样本中快速检测艰难梭菌毒素基因已有十多年历史，并已在很大程度上取代了细胞毒性试验或产毒培养。本研究评估了五种NAATs检测艰难梭菌的分析性能，包括两种多重GI检测试剂盒。QIAstat-Dx GIP 2检测的性能与其他市售艰难梭菌NAATs相当（表2至表4）。在产生测序数据的样本中，主要的tcdB亚型是tcdB1a（77%；n = 44），其次是tcdB2（15.8%）和tcdB4（3.5%），这与已发表的报告一致，即tcdB1（69.9%）和tcdB2（26.9%）在北美更常见，而tcdB1（66.3%）或tcdB3（29.5%）在东亚有报道。

BioFire检测到的艰难梭菌阳性样本数量最多（n = 63），而Verigene在本研究中检测到的数量最少（n = 53）。可变的检测目标（即tcdB与tcdA/B）、报告的检测限（LoD）和/或样本体积可能影响检测特异性检出率。对于检测多个艰难梭菌目标的NAATs（例如QIAstat、Verigene和BioFire），检测到tcdA或tcdB将导致“艰难梭菌阳性”判读，因此差异可能与样本中缺乏tcdB有关（参见下文汇总数据分析）。根据制造商测试的艰难梭菌菌株，每种NAAT的报告LoD各不相同。Verigene的LoD根据测试菌株不同而变化（63–1,250菌落形成单位[CFU]/mL），最终LoD定义为1,250 CFU/mL，而QIAstat-Dx、Xpert和BD MAX报告了较低的LoD（即41–832 CFU/mL）。Verigene使用粪便拭子，这也可能导致其较高的LoD，并可以解释本研究中检测到的阳性样本数量最少。值得注意的是，本研究中有六份样本仅在BD MAX检测上呈阳性（见下文讨论）；如果将这些结果排除为潜在假阳性，则BD MAX数据（n = 55）将与Verigene的总体阳性结果数量（n = 53）更接近。

与通过tcdB PCR和测序确认的样本（n = 57）相比