针对新发人畜共患病原体猪副链球菌的全基因组分型策略开发及其种群特征解析

《Journal of Clinical Microbiology》：Developing genome typing strategies for the emerging zoonotic pathogen Streptococcus parasuis

本研究针对新发人畜共患病原体猪副链球菌（Streptococcus parasuis）开发了一套基于全基因组测序（WGS）的分型策略，包括平均核苷酸一致性（ANI）、最小核心基因组（MCG）分型方案和多位点序列分型（MLST）方案。通过对255株S. parasuis基因组（分离自8个国家，时间跨度为1980年代至2024年）的分析，揭示了其种群结构分为12个MCG簇和2个谱系，MLST方案定义了161个序列型（ST）。该策略为S. parasuis的分类鉴定、流行病学监测及人畜共患潜力评估提供了快速、可重复且可扩展的工具，对制定有效的感染防控策略具有重要意义。

　　

ABSTRACT

随着猪副链球菌（Streptococcus parasuis）引起的人类感染病例报道不断增加，开发针对该病原体的快速、标准化基因分型工具对于流行病学监测和鉴定具有人畜共患潜力的菌株至关重要。本研究基于255株分离自8个国家（时间跨度为1980年代至2024年）的S. parasuis基因组，开发了一套基于全基因组测序（WGS）的分型策略，涵盖平均核苷酸一致性（ANI）、最小核心基因组（MCG）分型方案和多位点序列分型（MLST）方案。

INTRODUCTION

Streptococcus parasuis是一种新发的人畜共患病原体，可引起人类肺炎、脑膜炎、腹膜炎、胸膜炎和关节炎。2015年，猪链球菌（S. suis）血清型20、22和26被重新分类为S. parasuis，可通过特定的recN基因与S. suis区分。由于分类鉴定方法的局限性，S. parasuis常被误认为是S. suis，导致其公共卫生重要性被低估。迫切需要开发基于WGS的方案来鉴定和分型S. parasuis，以进行流行病学监测和致病菌株鉴别。

MATERIALS AND METHODS

Bacterial strains, identification, and antimicrobial susceptibility

研究分析了255个S. parasuis基因组，包括新测序的5株来自广西健康猪咽喉拭子的菌株和来自公共数据库的菌株。通过ANI分析（阈值设为94.82%）确认所有基因组均为S. parasuis。使用CheckM2评估基因组质量，确保完整性≥90%且污染<5%。

Development of the MCG typing scheme

通过基因预测和直系同源簇分析，从255个基因组中鉴定出708个核心基因。排除重组区域后，最终确定了607个MCG基因和72,172个非重组区域的单核苷酸多态性（SNP）位点。利用结构分析（Admixture软件）将S. parasuis种群划分为12个祖先亚群（MCG簇1-12）。基于最大似然法构建核心SNP系统发育树。还开发了一个MCG快速分型程序，通过识别簇/亚簇特异性SNP将基因组分配到相应的MCG簇。

Development of the MLST scheme

参考S. suis的MLST方案，选择了7个看家基因位点（aroA, cpn60, gki, mutS, recA, sdhA, 和 thrA）用于S. parasuis的MLST方案。所有位点的d_N/d_S比值均远小于0.1，表明未受正选择。根据等位基因谱定义序列型（ST），使用goeBURST算法将STs分组为克隆复合体（CCs）和ST枝（SCs）。

Discriminatory power of two typing schemes

使用Simpson多样性指数评估MCG和MLST分型方案的区分能力。

RESULTS

Development of the MCG typing scheme

S. parasuis种群被划分为12个MCG簇。在255个基因组中，217个被可靠地分配到相应的MCG簇（最高比例值>0.7），而38个被归类为MCG不可分组基因组。系统发育分析将基因组分为两个谱系（Lineage 1和Lineage 2）。时间标定系统发育树表明，S. parasuis种群的快速扩张发生在1960年代之后。MCG快速分型程序能准确地将92.5%的基因组分类到相应的MCG簇。

Development of the MLST scheme

MLST方案在255个基因组中定义了161个STs。32个STs（19.9%）被归类为10个CCs。ST76是主要的ST，包含30个基因组。

Relationship between the MCG clusters and STs

MCG分型方案和MLST方案的Simpson多样性指数分别为0.8864和0.9821，MLST方案显示出更高的区分能力。MLST分析有助于阐明MCG不可分组基因组的系统发育关系，特别是那些不可靠地分配到MCG簇4、7和11的基因组。

Genomic characteristics of S. parasuis genomes from patients

所有来自患者的S. parasuis基因组均明确地分配到MCG簇2，但显示出显著的遗传多样性，涵盖5个不同的STs。发现了一个包含三个基因的特有基因簇（1,270 bp），该簇为临床基因组所特有。

DISCUSSION

本研究揭示了S. parasuis种群的高度异质性。开发的WGS分型策略（包括MCG分型方案和MLST方案）将高通量测序数据转化为准确、可重复、可扩展和可比对的基因分型数据。该数据适用于流行病学监测、进化关系调查以及鉴定具有人畜共患潜力的菌株。尽管本研究中使用的基因组在地理和时间分布上存在偏差，但增加新的S. parasuis菌株将有助于扩大种群并增强该方案对S. parasuis流行病学监测的区分能力。所有来自人类感染病例的基因组均被明确分配到MCG簇2，并且局限于特定且独特的STs，这为精确预防和控制人类S. parasuis感染提供了有价值的临床和公共卫生信息。