脑脊液肠道病毒检测新方案：Diasorin直接扩增碟片与通用碟片实时PCR方法的评估与优化

《Journal of Clinical Microbiology》：Evaluation of a sample-to-answer real-time PCR assay for enterovirus detection in cerebrospinal fluid

本研究针对Cepheid Xpert EV检测试剂停产造成的诊断空白，评估了两种实验室自建的实时PCR（RT-PCR）方法——Diasorin直接扩增碟片（DAD）和通用碟片（UD）——用于脑脊液（CSF）中肠道病毒（Enterovirus）检测的性能。结果显示，DAD与UD方法与原标准方法相比，阳性符合率分别为79.6%和86.4%，阴性符合率均达100%，特异性高且无交叉反应，检测限（LoD）分别为1,000 copies/mL和250 copies/mL。研究表明，DAD与UD是Xpert EV可行的替代方案，对病毒性脑膜炎的快速诊断与患者管理具有重要意义。

　　

ABSTRACT

肠道病毒是病毒性脑膜炎的常见病因，快速准确地区分其与细菌性脑膜炎对避免不必要的抗菌治疗和改善患者管理至关重要。聚合酶链式反应（PCR）因其高灵敏度和快速周转时间，成为脑脊液（CSF）中肠道病毒检测的金标准。Cepheid Xpert EV检测试剂的停产给诊断带来了空白。本研究旨在优化两种实验室自建的实时PCR检测方法，分别使用Diasorin直接扩增碟片（DAD）和通用碟片（UD）方法，并与之前作为标准的Cepheid Xpert EV检测进行对比。共测试了87份临床CSF样本以评估灵敏度、特异性和整体性能。与标准护理结果相比，三种检测方法的性能无显著差异。Xpert EV和DAD方法的阳性符合率为79.6%，而UD方法的阳性符合率为86.4%。所有方法的阴性符合率均为100%。针对非肠道病毒病原体的特异性测试证实无交叉反应。Xpert EV的估计检测限（LoD）为100 copies/mL，UD为250 copies/mL，DAD为1,000 copies/mL，但临床灵敏度仍然很高。血液污染影响了DAD检测，但由于UD方法有RNA提取步骤，未受影响。本研究证明了DAD和UD方法作为Xpert EV检测停产后快速检测CSF中肠道病毒可行替代方案的潜力，这对患者管理至关重要。更广泛的临床应用需要进一步的验证和比较。

INTRODUCTION

肠道病毒感染常见且通常无症状或具有自限性。然而，肠道病毒是病毒性脑膜炎的主要原因，占全球病例的80%–92%。仅凭症状区分病毒性脑膜炎和更致命的细菌性脑膜炎仍然具有挑战性。病毒性脑膜炎的治疗主要是支持性的，而细菌性脑膜炎需要靶向抗菌治疗，死亡率高达50%。因此，脑脊液（CSF）中肠道病毒的快速诊断检测至关重要。及时的CSF肠道病毒阳性结果可以防止患者不必要的抗生素暴露，并促进更快速的对症管理和分诊。

聚合酶链式反应（PCR）因其与病毒培养相比周转时间快、灵敏度高，成为CSF样本中肠道病毒检测的金标准。目前，美国食品药品监督管理局（FDA）批准的用于CSF样本的肠道病毒诊断PCR检测方法很少。BioFire FilmArray脑膜炎/脑炎（ME） panel和QIAstat-DX脑膜炎/脑炎（ME） panel是多重PCR和阵列诊断方法，可评估中枢神经系统的常见细菌、病毒和真菌病原体，并在约1小时内得出结果。FilmArray ME panel检测肠道病毒的报道灵敏度为89%，特异性为100%。QIAstat-DX ME panel的灵敏度因肠道病毒株系而异，但对配制样本的报道灵敏度为88%–99%。Cepheid Xpert EV检测是唯一获得FDA批准、仅靶向肠道病毒的检测方法。该检测是一种实时RT-PCR检测，约2.5小时出结果，报道灵敏度为96%，特异性为99%。不幸的是，该检测已于2023年10月被生产商停产。鉴于肠道病毒性脑膜炎的诊断选择有限，我们描述了对一种利用市售分析物特异性试剂（ASR）检测CSF样本中肠道病毒的实验室自建样本到结果（sample-to-answer）实时PCR检测的评估。

MATERIALS AND METHODS

Specimens

本研究经华盛顿大学机构审查委员会批准（ID#202312029）。共使用了87份先前在巴恩斯犹太医院分子传染病实验室和圣路易斯儿童医院微生物学实验室进行常规临床检测的CSF样本。样本采集日期从2004年9月到2023年7月不等，并在初次临床分析后于–80°C储存。纳入标准要求至少1 mL的CSF样本以进行所有必要检测。其中44份样本先前通过标准护理分子诊断方法检测为肠道病毒阳性，另外43份样本先前检测为阴性。从2004年到2008年，巴恩斯犹太医院和圣路易斯儿童医院的标准护理分子诊断方法是使用Qiagen一步法RT-PCR试剂盒的实验室自建检测。2008年至2024年使用的方法是Cepheid Xpert EV RT-PCR检测。

DAD protocol optimization

测试了四种PCR方案以确定使用Diasorin 8孔直接扩增碟片（DAD）的最佳性能。DAD是一种8孔、样本到结果的PCR扩增碟片，使用前无需RNA提取。这四种方案试验了是否添加RNasin核糖核酸酶抑制剂（Promega，目录号N2615），以及是否进行过滤步骤以达到最佳性能。该检测的分析物特异性试剂购自Diasorin。Diasorin肠道病毒引物对（MOL9020）包含一个靶向保守5'非编码区的Scorpion引物/探针。该引物对靶向肠道病毒血清型68、70、71，以及其他柯萨奇病毒和埃可病毒。所有反应在扩增前立即制备，主混合物包含所有反应组分。通过比较对照材料稀释液的循环阈值（Ct值）来评估方案的灵敏度。最终选择了方案2（添加RNasin），因其在灵敏度和有利的循环参数（Ct值小于40）之间取得了平衡。该方案下文称为“DAD方法”，并将与96孔格式的Diasorin通用碟片（UD）以及Cepheid Xpert EV的性能进行比较。

Diasorin UD protocol

Diasorin UD方案使用可消耗的96孔UD进行PCR扩增，这需要额外的RNA提取步骤。提取前，将400 μL样本或对照与15 μL SEAC RNA模板（MOL9200）混合。SEAC RNA作为反应提取和扩增的内标。RNA提取在bioMerieux NucliSENS easyMAG上进行。使用5 μL提取的CSF样本或对照。其余反应组分总计5 μL，最终反应体积为10 μL。所有反应在扩增前立即制备为主混合物。PCR扩增在Diasorin LIAISON MDX仪器上进行，数据收集和分析使用LIAISON MDX Studio软件进行。

Cepheid Xpert EV protocol

Cepheid Xpert EV检测是一种用于检测CSF样本中肠道病毒RNA的样本到结果逆转录PCR（RT-PCR）检测。按照制造商说明在GeneXpert Dx系统上操作。

Comparative accuracy assessment

对87份先前检测过的临床CSF样本进行了DAD方法、UD方法和Xpert EV检测。将每种测试方法的性能与临床标准护理报告结果进行比较。计算阳性符合率（PPA）、阴性符合率（NPA）和总符合率（OPA）。通过bootstrapping计算置信区间（CI）。计算Cohen's Kappa值并按Landis和Koch的一致性分类进行解释。此外，还确定了三种测试检测之间结果的一致性以帮助比较性能。

Analytical specificity assessment

通过使用先前检测为非肠道病毒病原体阳性的残留临床CSF样本，评估了DAD和UD检测的分析特异性。还测试了包含多种病原体的对照样本。测试的病原体包括单纯疱疹病毒1型（HSV-1）、HSV-2、人类疱疹病毒6型（HHV-6）、水痘-带状疱疹病毒（VZV）、腺病毒、巨细胞病毒（CMV）、肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae）、细小病毒B19（Parvovirus B19）和帕雷霍病毒（Parechovirus）。

Comparative analytical sensitivity assessment/limit of detection

使用Xpert EV、DAD和UD检测，对5,000、1,000、500、250和100 copies/mL的对照材料（灭活的柯萨奇病毒A9，Exact Diagnostics）连续稀释液进行三次重复检测。比较了DAD检测对肠道病毒D68（Xpert EV检测因对该血清型的检测限较高而检测效率较低）的性能与Xpert EV的性能。使用先前肠道病毒阴性的患者CSF，对5,000、1,000、500、250、100、50和25 TCID₅₀/mL的Fermon肠道病毒D68 RNA稀释液在Xpert EV和DAD检测上各进行三次重复检测。每种检测的估计检测限（LoD）确定为三次重复中均能检测到（100%）的浓度。

Inhibition assessment

为确保检测对CSF中最可能遇到的抑制物质（EDTA抗凝血）的性能，我们使用CSF和EDTA血的稀释液进行了DAD和UD检测。将先前检测为肠道病毒阳性的CSF样本混合制成单个混合样本。该混合样本以“原液”以及稀释度A、B和C进行检测。每个稀释度的总体积为500 μL。

RESULTS

Demographic results

表1列出了所用临床样本患者的 demographics 信息。由于样本年代久远，部分记录早于当前使用的电子病历，因此某些数据无法获取（列为“未知”）。患者年龄分为三组：0至<2岁、2至<18岁和>18岁。使用Freeman-Halton扩展的Fisher精确检验分析该数据。年龄组之间存在统计学显著差异（P < 0.001），表明阳性队列更可能由非常年幼的儿童（<2岁）组成。使用Fisher精确检验评估两组性别构成的差异，统计学显著性设定为P < 0.05。阳性和阴性队列的性别构成无显著差异。对于其余数据点，使用Wilcoxon秩和检验比较阳性和阴性队列之间的差异。阳性和阴性队列之间的显著差异见于CSF有核细胞计数以及是否进行了CSF的额外病毒检测。阳性队列的CSF有核细胞计数高于阴性队列。阴性队列更可能同时进行CSF的HSV、VZV和Parechovirus检测。这些发现符合预期，因为病毒性脑膜炎临床表现而肠道病毒检测阴性会促使临床医生进行其他CSF病毒检测。

DAD protocol optimization

方案优化的结果见表S2。最终选择了方案二（添加RNasin），因其灵敏度最高且Ct值低于40。

Comparative accuracy

所有三种测试方法的准确性结果见表2。使用先前获得的标准护理检测作为金标准，三种检测方法的性能无显著差异。Xpert EV和DAD检测均识别出44份先前阳性样本中的35份，阳性符合率（PPA）为79.6%（95% CI 67.5%–90.7%），Cohen's Kappa为0.794。UD 96孔检测正确识别出44份阳性样本中的38份，PPA为86.4%（95% CI 75.6%–95.5%），Cohen's Kappa为0.862。所有三种检测均将43份先前阴性样本识别为阴性，即所有三种检测的阴性符合率（NPA）均为100%。Xpert EV和DAD检测的总符合率（OPA）均为89.7%（95% CI 83.9%–95.4%）。UD检测的OPA略高，为93.1%（95% CI 87.4%–97.7%）。三种测试检测均未观察到无效结果。三种测试检测之间的阳性结果一致性见图1。44份阳性样本中的29份（66.0%）被所有三种方法检测为肠道病毒阳性。44份阳性样本中的13份（30.0%）被一种或多种方法检测为阳性，但并非所有三种方法。44份先前阳性样本中的2份（5.0%）被所有三种方法检测为阴性。使用“三取二”复合参考标准，DAD显示灵敏度为91.9%，特异性为98%；UD的灵敏度为94.6%，特异性为94%；Xpert EV的灵敏度为91.9%，特异性为98%。不一致结果的Ct值范围分别为Xpert EV（32.2–37.9）、DAD（39.4–41.1）和UD（37.1–38.9）。这些发现表明，不一致性可能是由于这些样本中病毒载量低所致，因为Ct值较高。

Comparative analytical specificity

所有测试的病原体均未在DAD和UD检测中引发阳性结果，这表明在其它常见CSF病原体中，该检测对肠道病毒具有高特异性。

Comparative analytical sensitivity assessment/ limit of detection

估计检测限（LoD）研究的结果见表3。在测试的三种方法中，Xpert EV的估计LoD最低，为100 copies/mL。UD方法的估计LoD次之，估计为250 copies/mL。DAD方法的估计LoD为1,000 copies/mL。尽管这表明对测试的对照材料存在分析灵敏度的差异，但考虑到患者样本测试的结果，临床灵敏度的差异可能很小。标准护理Xpert EV方法与提议的DAD和UD方法之间的阳性符合率非常相似，其中UD方法的阳性符合率最高，为86.4%。所有三种方法的阴性符合率相同。D68比较分析的结果见表4。DAD检测的估计LoD较低，为25 TCID₅₀/mL，而Xpert EV检测的估计LoD为100 TCID₅₀/mL。这些结果表明，对于该血清型的检测，DAD检测比Xpert EV检测更灵敏。

Inhibition assessment

抑制测定结果列于表5。对于DAD方法，在血液与CSF的1:5稀释度下观察到定性抑制。由于该方法使用直接样本而无提取方法，这一结果可以预期。对于UD方法，在所有测试的血液水平下均未观察到定性抑制。这可能是由于PCR前额外的提取步骤提高了灵敏度。

DISCUSSION

虽然Cepheid Xpert EV一直是专用肠道病毒检测的标准护理，但其停产为快速肠道病毒检测创造了临床需求。本文中，我们描述了两种具有相似临床性能的替代方法。在权衡这些替代方案时，考虑检测时间和易用性很重要。标准护理Xpert EV检测需要最少的动手时间，而提议的DAD和UD方法需要更多的技术投入。UD方法必需的RNA提取步骤需要单独的仪器和更复杂的工作流程，这可能增加至少1小时的额外检测时间。

与已发表的研究相比，提议的DAD和UD方法显示出与CSF中肠道病毒检测方法相似的临床性能。Xpert EV报道的对CSF中肠道病毒检测的灵敏度为96%–100%。FilmArray ME和QIAstat-DX ME panel报道的对CSF中肠道病毒检测的灵敏度分别为89%和88%–99%。本文中，我们发现Xpert EV与DAD和UD方法之间的直接阳性符合率分别为79.6%和86.4%。基于这种一致性和复合参考分析，DAD方法的临床准确性可能适用于微生物学实验室的临床使用。

我们研究的一个关键优势是确定了两种用于病毒性脑膜炎快速诊断的潜在新方法。DAD方法是一种样本到结果的检测，类似于先前使用的标准护理Xpert EV方法，这对大型、繁忙的微生物学实验室是一个有吸引力的选择。UD方法性能相似，尽管其分析灵敏度可能更高。必须评估UD方法所需的延长RNA提取时间是否证明其在自己实验室和患者群体中应用的合理性。未来的研究可能需要对这两种方法进行进一步的临床比较。

CSF样本在腰椎穿刺过程中可能被血液污染。我们表明，血液污染至少达到1:5的稀释度会导致使用DAD检测无法检测到CSF样本中的肠道病毒。UD方法在测试的稀释度下未显示任何灵敏度下降。这可能是由于UD方法使用的离线提取步骤提高了灵敏度。其他使用DAD的研究已成功将患者样本用磷酸盐缓冲盐水1:1稀释以抵消污染，尽管这必须经过验证。总体而言，本研究及其他研究的结果表明，对于高血液抑制的样本，可以验证稀释方案，或者，UD方法可能是分析血性CSF样本的更合适选择。

我们研究的一个局限性是符合条件的阳性样本相对稀缺。本研究需要1 mL残留CSF；然而，CSF通常获取量有限。因此，一些测试样本距离原始采集时间长达19年，可能引入了选择偏倚，因为阳性队列包含比阴性队列更旧的样本。此外，RNA病毒颗粒的长期冷冻储存可能导致降解，这可能解释了一些不一致的结果。另外，样本的年代久远也给某些数据收集带来了挑战，导致 demographics 统计数据不完整。

我们研究的另一个潜在局限性是缺乏样本的血清分型。鉴于报道的Xpert EV方法对肠道病毒D68的检测限高于其他肠道病毒，Xpert EV方法可能未检测到阳性队列中D68株系的低病毒载量。未对阳性队列进行血清分型，无法就三种检测对临床样本中特定肠道病毒株系的性能得出明确结论。我们研究了DAD检测与Xpert EV检测对非临床样本中肠道病毒D68的检测性能，DAD证明对该特定血清型的检测具有分析灵敏度。

关于分析特异性，我们已经表明DAD和UD检测在对其他常见CSF病原体中的肠道病毒检测具有高特异性。然而，未评估对鼻病毒（rhinovirus）感染的特异性，这构成了本研究的一个局限性，因为已知通过核酸检测方法存在肠道病毒和鼻病毒之间的交叉反应。尽管鼻病毒感染是脑膜脑炎的极罕见原因，但我们承认，由于同源性程度，鼻病毒核酸的存在已被证明会在核酸扩增检测中引发交叉反应。Diasorin肠道病毒引物对已知不与鼻病毒结合；然而，它靶向肠道病毒的5'非编码区，因此需要对鼻病毒阳性临床样本进行进一步验证。

用于诊断病毒性脑膜炎的快速诊断检测对于指导治疗决策和住院时间至关重要。在商业可用检测相对缺乏的情况下，我们描述了两种用于CSF肠道病毒感染快速诊断的潜在替代方案。使用Diasorin分析物特异性试剂的DAD和UD方法均显示出与先前可用的FDA批准的Xpert EV检测相似的临床灵敏度。样本到结果的DAD检测满足我们实验室的可接受性验证标准，并已用于临床。