2022年中欧猴痘病毒分离株的全基因组测序分析及其进化意义

《Microbiology Resource Announcements》：Genome sequence of a human monkeypox virus isolate from Central Europe during the 2022 outbreak

本文报道了利用牛津纳米孔测序技术对2022年中欧地区早期猴痘病例病毒分离株MPXV_NRL_4279/2022进行的全基因组测序。该197,993 bp基因组GC含量为32.9%，属于IIb分支B.1.3亚型，揭示了四个位于基因间区的缺失和五个导致氨基酸改变的点突变。研究为理解猴痘病毒（hMPXV）的进化动力学提供了重要基因组资源。

　　

ABSTRACT

我们报告了从中欧早期病例中分离的一株人猴痘病毒的全基因组序列。通过牛津纳米孔方法对扩增子进行测序，组装得到197,993 bp的基因组。其GC含量为32.9%，属于IIb分支B.1.3亚型。

ANNOUNCEMENT

人猴痘病毒（hMPXV）是痘病毒科正痘病毒属的一种人畜共患病毒，与引起天花的病毒密切相关。2024年8月，世界卫生组织宣布hMPXV为国际关注的突发公共卫生事件，现已被列为具有大流行潜力的新兴病原体。

为更好地理解hMPXV的进化，我们对2022年从捷克布拉格一名患者皮肤损伤处获得的病毒分离株MPXV_NRL_4279/2022进行了测序。病毒在佩奇大学国家病毒学实验室的BSL-4条件下培养，并在Vero细胞（ATCC, CCL-81）中传代一次以产生足够量的感染性材料。使用Direct-zol RNA MiniPrep试剂盒（Zymo Research, USA）按照制造商说明书（不包括DNase I处理）进行DNA提取。

设计了22对多重PCR引物对，产生覆盖病毒基因组的约10 kb重叠扩增子。使用repliQa HiFi ToughMix（Quantabio）从具有50-100 bp重叠的片段中扩增复杂和重复的基因组区域。进行了两轮不同的PCR，每轮针对非重叠片段。使用SPRI beads（AmpureXP）按照制造商说明书纯化PCR产物。使用SQK-LSK110试剂盒（Oxford Nanopore Technologies, ONT）制备测序文库，并使用EXP-NBD196试剂盒进行条形码标记。在MinION Mk1B设备上使用R9.4.1流动细胞（FLO-MIN106）进行测序，产生29,404条读数，N50为9,556。

使用Guppy 6.5.7的超精确模型进行碱基识别和接头修剪，并使用NanoFilt2.8.0过滤掉低质量读数。使用Raven 1.8.3进行从头组装，产生两个重叠群，使用RagTag 2.1.0将其合并为一条序列。为确定精确的基因组末端，利用了对我们分离株进行的额外直接RNA测序结果，使用samtools生成一致性序列。该一致性序列与高度准确的密切相关基因组OXO44336.2的末端匹配。

完整的组装基因组长度为197,993 bp，GC含量为32.9%。未发现移码突变或提前终止密码子，表明蛋白质编码区没有重大中断。与参考基因组（NC_063383）比较，发现总长为33 bp的四个缺失，均位于基因间区。鉴定出五个核苷酸替换，其中三个导致OPG055（F11）、OPG130（A5L）和OPG016（N3R）基因内的氨基酸改变。此外，检测到七个插入：两个在末端，三个在可变数目串联重复区（VNTRs）内，以及两个小插入。使用Nextclade v3.10.2进行的全基因组系统发育分析表明，MPXV_NRL_4279/2022分离株属于hMPXV的IIb分支B.1.3亚型。这个与2022年多国疫情相关的基因组为理解痘病毒的进化动力学提供了宝贵的见解。

ACKNOWLEDGMENTS

作者感谢Gábor E. Tóth在实验室工作中提供的帮助。我们感谢匈牙利佩奇大学生物学与运动生物学博士学院为á.N.在博士研究期间提供的研究机会。Z.B.得到了国家研究、发展和创新办公室（NRDIO）的支持，资助号为K 142674。D.T.得到了NRDIO（FK 142676）的支持。I.P.得到了创新与文化部（由NRDI基金资助）的大学研究奖学金计划（EKOP-24-4-SZTE-377）的支持。新型测序方法的开发得到了匈牙利创新与文化部从国家研究、发展和创新基金的支持，在TKP2021资助计划下实施，项目编号为TKP-NVA-07。

DATA AVAILABILITY

序列已存入NCBI病毒基因组数据库，GenBank登录号为PV424067。原始测序读数可在BioProject ID PRJNA1241293下获取，并已存入序列读取档案（SRA），登录号为SRP572719。

ETHICS APPROVAL

猴痘病毒毒株（ID: MPXV_NRL 4279/2022）来自国家公共卫生研究所（捷克共和国）认证的生物样本库，最初为诊断目的而分离。未使用可识别患者数据，使用匿名生物样本库材料不需要伦理批准。