连接组蛋白H1.0调控多能造血干祖细胞髓系与淋巴系命运分化的分子机制

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Linker histone regulates the myeloid versus lymphoid bifurcation of multipotent hematopoietic stem and progenitors

本研究揭示了连接组蛋白（linker histone）H1.0在调控多能造血干祖细胞（HSPC）向髓系或淋巴系分化的关键作用。H1.0过表达通过增强核小体组织、降低特定基因组区域（如Hlf基因座）的染色质可及性，促进淋巴系分化；而炎症信号（如IFNα）通过天冬氨酸蛋白酶降解H1.0，导致髓系偏斜。研究为干预年龄相关髓系偏斜造血（myeloid-biased hematopoiesis）提供了新靶点。

　　

H1.0过表达在HSPCs中导致淋巴系生成增加并伴随MPP4和CLP扩增

研究团队首先通过慢病毒在野生型（WT）Lin^- Sca1⁺ cKit⁺（LSK）细胞中表达H1.0-GFP融合蛋白，并将其移植到经照射的同系宿主中。作为对照，同时表达了HMGN1-GFP和H2B-GFP。移植后，H1.0-GFP⁺细胞产生了更多的淋巴细胞（B220⁺ B细胞和CD3⁺ T细胞），而HMGN1-GFP⁺细胞则产生更多的髓系后代（CD11b⁺）。H2B-GFP⁺细胞则表现出平衡的谱系贡献，表明H2B作为荧光蛋白融合标签过表达不改变血细胞谱系分布。

为了更精确地评估H1.0水平如何调节HSPC的谱系选择，研究人员通过将H1.0-GFP的编码序列靶向到Hprt基因座，构建了多西环素（dox）诱导型转基因敲入小鼠（X^iH1.0-GFP）。同时，平行构建了X^{iHMGN1-mCherry}等位基因作为对照，以模拟H1的功能性拮抗。由于Hprt基因座位于X染色体上，经dox处理的雌性杂合子（X^wtX^iH1.0-GFP）由于随机X染色体失活，会包含转基因阳性和阴性的细胞混合物。

通过将X^wtX^iH1.0-GFP雌性小鼠的全骨髓非竞争性移植到致死剂量照射的WT受体中，并饲喂dox水，研究人员在长达16周的时间内监测了供体细胞在外周血（PB）中对B、T和髓系谱系的贡献。与慢病毒表达H1.0的结果一致，转基因H1.0-GFP⁺细胞产生了更多的淋巴细胞，且这种表型随时间推移而增强。尽管H1.0-GFP⁺区室内的淋巴系重建水平更高，但所有受体小鼠的全血细胞计数（CBC）均在正常范围内，表明H1.0-GFP⁺细胞与转基因阴性细胞一起遵循稳态控制。

使用雄性供体小鼠（X^iH1.0-GFPY）的实验也观察到类似的结果，在荧光强度更高的H1.0-GFP⁺细胞（+dox GFP^high）中，淋巴/髓系比率增加。此外，与慢病毒表达转基因的观察结果一致，来自iHMGN1-mCherry供体骨髓的+dox mCherry^high细胞显示出降低的外周血淋巴/髓系比率。HMGN1过表达对谱系的相反影响与已知的H1-HMGN1拮抗作用一致。

为了评估转基因对骨髓HSPCs的影响，研究团队建立了分别移植了X^iH1.0-GFPY或X^{iHMGN1-mCherry}Y全骨髓的WT受体小鼠队列，饲喂dox水，并在16周后分析HSPC数量。在移植了iH1.0-GFP骨髓的小鼠中，淋巴偏向的MPP4、共同淋巴祖细胞（CLP）和短期造血干细胞（ST-HSC）数量增加。而在移植了iHMGN1⁺骨髓的小鼠中，髓系偏向的MPP2/MPP3增加，髓系定向祖细胞的变化很小。

利用X染色体携带的转基因，研究人员可以在同一只动物内比较表达不同转基因的HSPCs，从而减少变异并控制细胞外在因素。他们将来自雌性X^iH1.0-GFPX^{iHMGN1-mCherry}供体的全骨髓非竞争性移植到致死剂量照射的WT受体中，并饲喂dox水。虽然在移植后4周时，H1.0-GFP⁺和HMGN1-mCherry⁺细胞的丰度相似，但所有受体中H1.0-GFP⁺细胞的百分比随时间推移而增加，这是由于B细胞和T细胞的增加所致，导致每个受体内的淋巴/髓系比率更高。移植16周后，淋巴偏向的MPP4以及淋巴定向的CLP在每个受体中显著扩增，其中iH1.0-GFP⁺细胞在这些区室中占主导地位。相比之下，MPP2/3和髓系定向祖细胞的变化很小。来自同一只小鼠的iH1.0-GFP⁺骨髓细胞形成的淋巴集落形成单位（CFU）比iHMGN1-mCherry⁺细胞多5倍，而两组的髓系CFU相似。当将X^iH1.0-GFPX^{iHMGN1-mCherry}骨髓移植到次级受体中时，即使是髓系谱系也主要由H1.0-GFP⁺细胞重建，表明H1.0^high HSCs长期保持功能。

综上所述，提高H1.0水平会导致淋巴生成增加，表现为MPP4-CLP区室的扩增以及血液中更多的B/T细胞。值得注意的是，内源性H1.0 mRNA在HSPCs和CLPs中高水平表达，表明H1.0水平的变化伴随着HSPC向淋巴系定向。

H1.0过表达的HSPCs在部分基因组区域显示染色质可及性降低并与核小体组织增强相关

转基因H1.0的表达预计会增加H1蛋白水平，从而降低染色质可及性。研究人员首先通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）验证了转基因HSPCs中H1.0蛋白的增加，使用先前验证的三重H1基因敲除（TKO）的小鼠胚胎干细胞（mESCs）作为对照。他们发现，在WT LSK细胞中，H1.0约占总H1库的1.3%，而在iH1.0⁺ LSK细胞中，这一比例增加到约18%。其他主要H1亚型的丰度没有显著改变。因此，内源性H1.0在HSPCs的总H1池中只占一小部分；转基因H1.0的表达并未引起其他H1亚型的明显补偿。H1.0水平升高导致H1.0/核小体比率从LSK细胞中的0.025增加到0.125。在粒细胞-巨噬细胞祖细胞（GMPs）中也检测到可比的H1.0蛋白增加，尽管它们的区室大小没有差异。这些结果证实了iH1.0-GFP⁺ HSPCs中总H1.0蛋白的增加；然而，转基因的效果似乎因细胞类型而异，表明细胞环境可能修饰转基因的效应。

为了理解增加的H1.0如何调节HSPC区室大小，研究人员检测了H1.0^high LSK细胞中的核小体组织。由于核小体DNA对ATAC-seq分析中使用的Tn5转座酶的可及性较低，绘制ATAC-seq数据中DNA片段长度的分布可以揭示具有已知核苷酸序列和染色质标记的基因组区域的核小体组织信息。他们比较了iH1.0-GFP⁺和WT LSK细胞的ATAC-seq结果。每种细胞类型都有超过32,000个ATAC-seq峰，其中约5%的峰响应H1.0转基因显示出差异可及性。研究人员使用更严格的 cutoff（P < 0.001且倍数变化 > 4），在iH1.0⁺ LSK细胞中鉴定出242个比WT LSK细胞更封闭的区域，以及78个更开放的区域。iH1.0⁺细胞中封闭区域多于开放区域，这与连接组蛋白的染色质压缩功能一致。iH1.0⁺细胞中的开放染色质区域与基因组中核小体密度不均匀的事实一致。差异可及的染色质区域在启动子、UTR、内含子、外显子和远端基因间区域的分布上，在WT和iH1.0⁺ LSK细胞中相似。值得注意的是，在iH1.0⁺ LSK细胞中，只有≤10%的封闭区域被注释为启动子，而绝大多数是内含子和远端基因间区域。除非放宽cutoff，否则未检测到转录因子（TF）结合基序的富集。这些结果表明，在H1.0^high LSK细胞中，全基因组的染色质可及性总体上保持相似，但在部分基因组区域染色质封闭更为明显。

为了进一步研究升高的H1.0如何调节全基因组的核小体组织，研究人员使用经过充分验证的染色质/组蛋白标记定义的25种染色质状态图（ChromHMM），评估了核小体重复模式。该分析揭示了H1.0转基因表达后染色质可及性的三种响应类型。A型染色质在WT或iH1.0⁺ LSK细胞中均只有最小的核小体重复模式，并且在两种基因型之间相似。B型染色质在WT LSK细胞中具有较弱的核小体重复信号，而在iH1.0⁺ LSK细胞中，核小体重复信号增加了约4个碱基对，这与H1对核小体DNA的保护增强一致。最显著的变化见于C型染色质，其中H1.0过表达显著增强了核小体重复模式。因此，H1.0^high LSK细胞在一小部分染色质区域的可及性降低；并非所有基因组区域都以相同的方式响应H1.0的增加。

接下来，研究人员检查了这25种染色质状态，以确定与H1.0响应最显著、导致染色质关闭相关的特征。令人惊讶的是，相当一部分C型染色质被指定为静息状态，即它们既缺乏激活型也缺乏抑制型染色质标记。此外，C型染色质包括带有抑制性染色质标记的异染色质以及活性染色质。更仔细的检查显示，大多数C型染色质似乎含有较低的GC含量。考虑到先前有报道称H1.0偏好高GC区域，研究人员的结果表明，部分基因组区域（即C型）可能因为其固有的对H1.0的低亲和力，而对增加的H1.0水平表现出更高的响应性；当连接组蛋白变得丰富时，这些区域可能对H1.0更具吸引力，而天然偏好H1.0的区域则显示很少的进一步变化。综上所述，这些结果可以支持一种基于核小体组织的解释，说明多能HSPCs如何倾向于淋巴系命运；关键的细胞命运调节因子可能位于此类区域，并对波动的连接组蛋白水平做出响应。

H1.0通过降低HSPCs中Hlf的染色质可及性和基因表达来促进淋巴潜能

研究人员接下来检查了位于iH1.0⁺ LSK细胞中封闭基因组区域内的基因。作为进一步的对照，他们将结果与在WT HSPC分化为谱系偏向或定向祖细胞过程中生成的参考ATAC-seq数据集进行了比对。当根据统计显著性和效应大小的强度对iH1.0⁺ LSK细胞中242个差异最显著的封闭染色质区域进行排名时，他们发现排名最靠前的区域是Hprt启动子，这是转基因的宿主基因座，可能反映了转基因盒引入的染色质可及性差异，并且在WT HSPC分化过程中未见差异。排名接下来的基因是Tspan9和Hlf。Tspan9主要在巨核细胞和血小板中表达，而Hlf是最公认的HSC基因之一。此外，许多已知在髓系偏向HSCs（my-HSCs）中上调的基因，如Thbs1、Slamf1和Itgb3，在iH1.0⁺ LSK细胞中显示出降低的染色质可及性，这表明H1.0介导的染色质机制可以塑造定义my-HSC身份的基因表达程序。这些结果进一步支持了H1.0的促淋巴功能，并指出了在髓系与淋巴系命运分叉点背后的关键基因组靶点。

考虑到Hlf作为HSC重编程转录因子的功能作用，研究人员重点研究了H1.0可能通过调节Hlf来赋予淋巴命运偏好。Hlf是一种PAR bZip家族转录因子，其表达驱动髓系定向同时干扰淋巴分化。iH1.0⁺ LSK细胞中Hlf基因组区域染色质可及性的降低可能导致其表达下降，并驱动H1.0^high HSPCs更优的淋巴潜能。在Hlf基因周围，iH1.0⁺ LSK细胞中ATAC-seq峰降低最显著的区域是位于Hlf基因约1 kb 3'端的一个基因间区域。ChromHMM将该区域注释为大部分是“静息-状态0”、“多梳-状态3”和“增强子样-状态4”；其间散布着几个“核酸酶可及-状态5”区域。值得注意的是，ChromHMM状态0、3和4都属于C型染色质。使用跨越该区域的引物对Tn5片段化DNA进行qPCR，证实了iH1.0⁺ LSK细胞中该区域的染色质可及性降低。该区域和Hlf基因体的GC含量约为46%。引人注目的是，该区域在WT HSC分化为淋巴偏向的MPP4过程中逐渐关闭，并且在CLP中几乎完全失去ATAC-seq信号。该区域可及性在WT HSPC分化过程中的变化表明其具有功能。事实上，该区域包含一个ChromHMM状态4的“增强子样”区域，具有C型响应，在H1.0^high LSK细胞中显示出增强的核小体重复。

接下来，研究人员通过RT-qPCR检测了iH1.0⁺和WT LSK细胞中Hlf的表达是否改变。在新鲜的LSK细胞中，他们发现与WT细胞相比，iH1.0⁺细胞中的Hlf mRNA显著减少。培养4天后，无论基因型如何，Hlf的表达都变得检测不到，这与HSPCs进一步分化时Hlf表达丢失一致。

为了确定H1.0赋予的淋巴潜能是否依赖于降低Hlf，研究人员从病毒构建体中表达了Hlf。将WT LSK细胞转导了过表达H1.0、Hlf或两者均过表达的病毒构建体，然后铺板到允许淋巴或髓系集落形成的甲基纤维素培养基中。正如预期的那样，H1.0过表达增加了淋巴CFU。然而，这种增加的淋巴潜能被Hlf的共表达所废除。所有条件下形成的髓系CFU相似。综上所述，这些数据支持了这样的模型：H1.0至少部分地通过降低髓系驱动基因Hlf的染色质可及性和基因表达来促进多能HSPCs的淋巴命运。

H1.0水平受生理和药理学调控

上述结果表明，H1.0水平可能是生理状态下调节髓系与淋巴系谱系输出的一个调控点。研究人员推断，H1.0水平的变化可能反映在H1.0-GFP融合蛋白的荧光强度上。在经dox水短暂处理（1周）的雌性X^iH1.0-GFPX^{iHMGN1-mCherry}小鼠中，大多数HSPC区室中表达任一转基因的细胞百分比大致相等，这与随机X染色体失活的预期一致。然而，淋巴偏向的MPP4主要由H1.0-GFP⁺细胞主导，导致LSK区室内H1.0-GFP⁺细胞明显占优势。引人注目的是，在LSK细胞中，淋巴偏向的MPP4显示出更亮的H1.0-GFP荧光。相比之下，MPP4中的HMGN1-mCherry强度与其他LSK亚群相似。经dox水较长时间处理（3周）后，在此期间H1.0-GFP⁺ HSPCs可能经历了进一步分化，CLPs显示出比LSK更亮的H1.0-GFP。这些结果与H1.0过表达后MPP4-CLP区室扩增的现象相呼应。因此，淋巴偏向和淋巴定向的细胞显示出更亮的H1.0-GFP，而非HMGN1-mCherry。研究人员将这些结果解释为HSPCs中H1.0水平存在潜在调控的迹象。

考虑到蛋白酶调节HSPC生物学，研究人员假设某些蛋白酶可能参与调节H1.0水平。他们筛选了一组蛋白酶抑制剂，寻找那些能够增加表达dox诱导型H1.0-GFP（iH1.0-GFP）的BaF3细胞中H1.0-GFP荧光强度的抑制剂。iH1.0-GFP BaF3细胞用dox加蛋白酶抑制剂处理，然后通过流式细胞术评估H1.0-GFP荧光强度。半胱氨酸蛋白酶抑制剂（E64）、半胱氨酸/丝氨酸/苏氨酸蛋白酶抑制剂（亮抑蛋白酶肽）和钙蛋白酶抑制剂（calpeptin和PD150606）没有改变H1.0-GFP强度；丝氨酸蛋白酶抑制剂（pefabloc）有轻微效果，而天冬氨酸蛋白酶抑制剂胃酶抑素（pepstatin）则持续且显著地增加了H1.0-GFP强度。表达空载体（EV）编码GFP（EV-GFP）的对照BaF3细胞在所有处理条件下具有相似的荧光强度。这些结果表明，H1.0-GFP被天冬氨酸蛋白酶活性降解。重要的是，胃酶抑素也增加了BaF3细胞中的内源性H1.0蛋白。研究人员接下来检测了胃酶抑素是否同样调节LSK细胞中的H1.0-GFP水平，并发现情况确实如此。然而，pefabloc对LSK细胞中的H1.0-GFP强度影响可忽略不计，尽管它在BaF3细胞中有轻微效果，因此未进一步研究。研究人员推断，LSK细胞中H1.0-GFP荧光强度的变化可以作为识别HSPCs中内源性H1.0调节因子的报告指标。

为此，研究人员探究炎症信号是否可能发挥作用，因为炎症常导致髓系偏向造血。他们首先用一组免疫刺激剂处理H1.0-GFP⁺ LSK细胞，并测量它们的H1.0-GFP强度。结果显示，不同的免疫刺激剂产生了不同的H1.0-GFP水平，表明H1.0调控具有信号依赖性。重要的是，干扰素α（IFNα）可重复地降低了H1.0-GFP强度，并且与胃酶抑素共同处理阻断了这种降低。接下来，研究人员检测了内源性H1.0水平是否同样被IFNα降低。结果显示，IFNα同样降低了内源性H1.0水平，并且在WT LSK细胞中，这种降低也被胃酶抑素所阻断，这与LSK细胞中转基因H1.0-GFP的变化相平行。这种效应是IFNα特异性的，因为IFNγ没有改变H1.0水平。为了检测IFNα处理是否诱导了天冬氨酸蛋白酶活性，研究人员评估了其中一种天冬氨酸蛋白酶——组织蛋白酶D（cathepsin D）在LSK细胞裂解液中的蛋白水解活性，并检测到适度但一致的增加。综上所述，HSPCs中的H1.0水平可以受到IFNα触发事件的调控。

最后，研究人员检测了蛋白酶抑制剂引起的H1.0水平增加是否能够转化为HSPC谱系命运选择的变化。与其保存H1.0的效果一致，胃酶抑素增加了WT LSK细胞的淋巴CFU数量，而不改变髓系CFU，表明天冬氨酸蛋白酶的药理学抑制剂可能对HSPCs具有谱系调节作用。值得注意的是，HIV蛋白酶是一种天冬氨酸蛋白酶，已有多种安全有效的抑制剂用于临床。为了测试天冬氨酸蛋白酶抑制剂调节正常HSPC谱系命运选择的转化可能性，研究人员用胃酶抑素或阿扎那韦（atazanavir，一种临床使用的HIV蛋白酶抑制剂）处理人脐带血CD34⁺细胞。胃酶抑素和阿扎那韦都增加了内源性H1.0蛋白水平。与H1.0水平增加一致，阿扎那韦也增加了WT LSK细胞的淋巴CFU，而不改变髓系CFU，效果与胃酶抑素相似。综上所述，研究结果暗示了天冬氨酸蛋白酶抑制剂在对抗衰老过程中观察到的髓系偏向HSPCs并增强其淋巴潜能方面具有潜在的转化应用机会。

讨论

本研究结果描绘了多能HSPCs中一种连接组蛋白驱动的细胞命运调控机制。研究表明，通过增加单一连接组蛋白H1.0的水平，可以编程多能HSPCs使其倾向于淋巴命运。这些结果与缺乏单个H1基因通常表型后果轻微的观察形成对比。提升其他H1亚型是否会导致HSPC谱系命运选择的类似变化，仍是一个悬而未决的问题。作为其调控功能的佐证，内源性H1.0水平根据HSPC的分化阶段以及响应生理信号（如IFNα）而变化。已有报道称连接组蛋白与干扰素刺激基因（ISGs）结合并抑制其表达，而H1耗竭可触发干扰素反应。结合本研究数据显示H1.0水平响应IFNα而降低，当H1.0水平低时，ISGs可能处于过度激活的准备状态，这将H1.0和IFNα信号置于一个正反馈循环中。这与“炎症衰老”（inflamm-aging）的概念一致，即过度/延长的干扰素信号伴随衰老和髓系偏向。在这种模型中，天冬氨酸蛋白酶抑制剂可能打破由炎症和低H1水平组成的恶性循环，胃酶抑素和临床使用的蛋白酶抑制剂阿扎那韦似乎可以实现这一点。尽管组蛋白的蛋白水解在中性粒细胞胞外陷阱（NET）形成或NETosis过程中已被广泛研究，但核心组蛋白的蛋白水解切割可以在不发生细胞死亡的情况下发生，例如单核细胞分化为巨噬细胞时。为了证明H1.0对HSPCs的细胞自主性效应，本研究中的大多数实验使用了移植模型，这可能提供了一个更具炎症性的微环境；未来的研究可以剖析发炎的骨髓环境对观察到的表型的贡献。在造血谱系之外，已有报道称组织蛋白酶L在小鼠胚胎干细胞分化过程中切割H3，组织蛋白酶D在乳腺复旧过程中切割H3。明确蛋白酶下调H1的模式将极大地增进我们对连接组蛋白如何与基于核小体/染色质的细胞命运控制相整合的理解。

H1.0的促淋巴功能至少部分是通过染色质抑制髓系驱动基因Hlf介导的，后者细胞类型特异性的表达模式可能解释了细胞环境对H1.0过表达的不同响应。具体而言，虽然LSK和GMP相似地表达转基因H1.0，但细胞命运调节效应在LSK亚群中似乎更为显著，这与H1.0介导的Hlf抑制相关。尚待确定的是，H1.0是否能够调节那些Hlf基因组区域已经关闭的细胞中的命运选择，或者通过其他靶基因起作用，因为许多my-HSC基因的染色质可及性降低了。介导H1响应的染色质特征出人意料，因为差异最显著的封闭染色质区域位于Hlf基因的3'端远端——此类区域的核小体组织和染色质可及性如何调节Hlf表达仍有待确定。目前的数据指向低GC含量是差异封闭染色质区域的一个潜在基因组特征。在这方面，研究人员注意到Satb1，一种结合AT富集基因组区域的蛋白，能促进淋巴生成，这提出了Satb1与H1功能合作的可能性。这一特征也暗示了与偏好GC富集区域的转录因子（如CTCF）存在潜在交叉对话。GC含量和核小体调控如何与造血谱系决定中的谱系指导性转录因子相互作用，也有待未来的研究，一个令人兴奋的例子是由一种AT富集小沟结合药物驱动的PU.1重新分布所导致的髓系分化。