人真皮成纤维细胞负载微孔退火颗粒支架在长期体外培养中的机械成熟研究

《Acta Biomaterialia》：Mechanical Maturation of Human Dermal Fibroblast-laden Microporous Annealed Particle Scaffolds During Long-term In Vitro Culture

本研究针对传统3D体外培养系统长期稳定性差、细胞相互作用受限等问题，开展了基于微孔退火颗粒(MAP)支架的长时程体外培养研究。通过对比酶不敏感(PEG-PEG)与酶敏感(PEG-peptide)两种支架配方，发现PEG-peptide支架在28天时机械模量显著增加，且细胞活性可维持63天。转录组分析证实ECM相关基因表达存在显著差异。该研究为组织工程和疾病建模提供了可靠的长期体外培养平台。

　　

在生物医学研究领域，科学家们一直致力于在实验室中模拟人体组织和疾病状态，以期更好地理解生理和病理过程。传统的二维细胞培养虽然操作简便、成本较低，但其简单的平面结构无法真实再现人体内细胞所处的复杂三维微环境。研究表明，细胞在二维和三维环境中会表现出截然不同的行为特征，这促使研究人员开发各种三维培养技术来弥补这一缺陷。

水凝胶作为一种能模拟细胞外基质(ECM)的材料，在三维细胞培养中显示出巨大潜力。然而，传统的块状水凝胶存在一个显著局限：其纳米级孔隙结构限制了营养物质的扩散，且细胞需要先降解材料网络才能迁移和增殖，这延迟了细胞间直接接触信号的传递，不利于长期培养。另一方面，自组装球体技术虽然能促进细胞-细胞相互作用，但其复杂的培养设置和可能出现的核心坏死问题也限制了其在长期研究中的应用。

面对这些挑战，弗吉尼亚大学生物医学工程系的Donald R. Griffin团队开发了一种新型的微孔退火颗粒(MAP)支架技术。这种支架结合了传统水凝胶的可调性和球体培养的优势，通过具有细胞尺度互连孔洞的结构，允许细胞立即迁移和增殖，无需等待材料降解。本研究特别关注了MAP支架在长期体外培养中的表现，相关成果发表在《Acta Biomaterialia》上。

研究人员主要采用了微流控技术制备均匀的PEG基微凝胶，通过机械压缩测试评估支架模量变化，利用活/死细胞染色分析细胞活性，并运用批量RNA测序技术进行转录组分析。研究使用了来自Lonza的原代人真皮成纤维细胞(hDF)作为模型细胞。

3.1. PEG-PEG和PEG-peptide MAP支架的合成与表征

研究人员设计了两种不同的MAP支架：一种使用PEG-PEG交联(酶不敏感)，另一种使用PEG-peptide交联(酶敏感)。通过精确调控材料配方，确保两种支架的杨氏模量(约20 kPa)、颗粒尺寸(约76-77 μm)和孔径(约13 μm)相匹配，从而将交联剂类型作为唯一变量进行后续细胞研究。

3.2. hDF负载的PEG-peptide MAP支架的机械成熟

将hDF以高密度(10,000 cells/μL)接种于两种支架中，培养63天并定期测试机械性能。结果显示，PEG-peptide支架在28天时模量显著增加，而PEG-PEG支架在整个培养期间模量保持稳定。进一步实验发现，标准胎牛血清中的蛋白酶会导致PEG-peptide支架降解，而使用热灭活血清则可维持其长期稳定性。

3.3. MAP支架中63天坏死区域的检测

活/死细胞染色分析表明，两种支架在整个培养期间均保持高细胞活性(约90%)，且活死细胞均匀分布，无坏死核心形成。这证明了MAP支架即使在髙细胞密度下也能维持良好的营养物质扩散，适合长期培养。

3.4. 批量RNA测序显示PEG-peptide支架与PEG-PEG支架的差异

转录组分析发现，两种支架中的细胞基因表达在培养后期出现显著差异。特别是在28天时，PEG-peptide支架中多种细胞外基质相关基因(如COL5A1、COL12A1、COL14A1、COL15A1)表达上调，而基质金属蛋白酶(MMP1、MMP3)和纤维连接蛋白(FN1)表达下调。这种基因表达模式与组织修复和ECM沉积过程相似。

本研究通过长期培养实验证明，MAP支架能维持细胞活性超过63天，且酶敏感型PEG-peptide支架能促进ECM沉积和机械成熟。转录组数据进一步揭示了材料降解性与细胞ECM重塑反应之间的密切关系。这些发现不仅为组织工程和疾病建模提供了可靠的长期体外培养平台，也为优化支架配方以促进材料-组织杂交提供了重要见解。未来研究将进一步解析降解性与材料组成之间的关系，推动MAP技术在再生医学中的应用。