基于氢氘交换质谱的SARS-CoV-2核衣壳蛋白诊断抗体表位定位研究

《Biophysical Journal》：Epitope Mapping of Diagnostic Antibodies Targeting SARS-CoV-2 Nucleocapsid Protein Using Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry

本研究针对SARS-CoV-2核衣壳（N）蛋白诊断抗体结合位点不明的问题，采用氢氘交换质谱（HDX-MS）技术开展表位定位研究。结果揭示了决定抗体特异性的关键表位，发现了N蛋白的保守区域，为开发高灵敏度、高特异性且能有效应对病毒变异的下一代COVID-19诊断工具提供了重要依据。

　　

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）疫情在全球范围内对人类健康和社会经济造成了巨大冲击。快速、准确地检测病毒是控制疫情的关键环节。SARS-CoV-2（严重急性呼吸综合征冠状病毒2）的核衣壳蛋白（Nucleocapsid, N）因其在病毒感染周期中大量表达且高度保守，成为免疫诊断试剂的理想靶点。基于抗体的检测方法，如侧向流免疫层析试纸条和酶联免疫吸附试验（ELISA），在临床诊断和流行病学调查中被广泛应用。然而，随着病毒的不断变异，新的变异株（Variants of Concern, VOCs）层出不穷，这些变异可能导致病毒蛋白结构发生改变，进而可能影响现有诊断抗体与靶标蛋白的结合效率，造成诊断准确性的下降，即出现假阴性或灵敏度降低的风险。因此，精确了解现有诊断抗体所识别的具体表位（Epitope），即抗体与抗原蛋白结合的确切区域，对于评估诊断试剂对当前及未来变异株的有效性、指导诊断抗体的改进与优化、乃至设计具有广谱识别能力的下一代诊断工具至关重要。传统表位定位方法存在分辨率有限或对蛋白质天然构象有影响等局限性。为了解决这一问题，研究人员迫切需要一种能够在接近生理条件下、高分辨率地解析蛋白质-抗体相互作用界面的技术。

本研究发表于《Biophysical Journal》，旨在利用氢氘交换质谱（Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry, HDX-MS）这一先进技术，对靶向SARS-CoV-2 N蛋白的诊断抗体进行精确的表位作图（Epitope Mapping），以期揭示抗体结合的关键区域，为提升诊断工具的鲁棒性（Robustness）提供科学依据。

研究人员主要应用了氢氘交换质谱（HDX-MS）这一关键技术。该方法的核心原理是：蛋白质主链酰胺氢与溶剂中的氘（Deuterium, D）会发生交换，交换速率取决于氢原子的溶剂可及性（Solvent Accessibility）和蛋白质的动态结构。当抗体与抗原（此处为N蛋白）结合后，结合位点（即表位）及其邻近区域的构象可能会变得稳定，溶剂可及性降低，从而导致该区域的氢-氘交换速率减慢。通过比较抗体结合前后N蛋白不同肽段的氘代水平（Deuterium Incorporation）差异，即可精确推断出抗体结合的表位区域。该技术无需晶体培养或复杂的蛋白工程，能够在溶液状态下反映蛋白质的天然构象和动态变化，提供高分辨率的相互作用信息。

HDX-MS揭示诊断抗体的特异性表位

通过HDX-MS分析，研究人员比较了多种诊断抗体与SARS-CoV-2 N蛋白结合前后蛋白各区域的氢-氘交换动力学变化。结果显示，不同的诊断抗体诱导了N蛋白不同区域氢-氘交换速率的显著降低。这些受到保护的区域（Protected Regions）被精确地定位到N蛋白的特定结构域上，明确了每个抗体所对应的独特表位。这表明，尽管这些抗体都靶向N蛋白，但它们识别的具体氨基酸序列或空间构象存在差异，这直接决定了它们各自的特异性。

鉴定出N蛋白的保守区域对诊断至关重要

进一步分析发现，部分抗体所识别的表位位于SARS-CoV-2 N蛋白高度保守的区域。这些区域在不同变异株中的序列高度一致，不易发生突变。识别这些保守表位的抗体，其结合能力受病毒变异的影响可能较小。这一发现为筛选和设计能够广谱识别不同SARS-CoV-2变异株的诊断抗体提供了关键靶点，有助于确保诊断试剂在面对未来可能出现的病毒变异时仍能保持较高的检测可靠性。

HDX-MS为优化诊断工具设计提供分子见解

本研究详细展示了HDX-MS如何提供关于抗体-抗原相互作用的分子水平见解。除了直接定位表位，HDX-MS数据还能揭示抗体结合引起的蛋白质远程构象变化（Allosteric Effects），即结合事件可能影响远离结合位点的蛋白区域的动态特性。这些信息对于深入理解抗体如何影响抗原蛋白的功能、评估抗体结合对蛋白稳定性的影响以及指导抗体配对（用于夹心法检测）以避免空间位阻具有重要意义。

本研究通过HDX-MS技术成功绘制了靶向SARS-CoV-2 N蛋白的诊断抗体的精确表位图谱。研究结论明确指出，不同的诊断抗体结合于N蛋白上 distinct（独特）且特异性的表位，其中一些表位位于病毒的保守区域内。这一发现具有多重重要意义：首先，它从分子层面解释了现有诊断抗体的作用机制和潜在的特异性来源。其次，它鉴定出的保守表位为开发对病毒变异具有更强适应性的下一代诊断试剂指明了方向，有助于提升诊断的持久性（Durability）。最后，该工作有力地证明了HDX-MS作为一种强大的工具，在传染病诊断领域抗体表征和试剂开发中的巨大应用价值。讨论部分强调，基于这些表位信息，可以更有针对性地评估现有诊断试剂对新兴变异株的检测效力，并理性设计具有更广谱识别能力和更高亲和力的抗体，从而最终增强COVID-19诊断的准确性、灵敏度和对未来疫情的应变能力。这项研究不仅为应对当前疫情提供了科学支持，也为未来应对其他新发传染病病原体的诊断工具开发建立了可借鉴的技术路线。