CRISPR微针原位检测皮肤间质液细菌：无需扩增的床旁诊断新平台

《Biosensors and Bioelectronics》：In Situ Detection of Bacteria from Skin Interstitial Fluid via CRISPR Microneedles: An Amplification-Free Platform for Point-of-Care Diagnostics

本文报道了一种CRISPR/Cas12a功能化微针（MN）生物传感器，该传感器可直接从皮肤间质液（ISF）中实现病原菌DNA的原位、无需扩增检测。该平台将导电聚苯乙烯/金/氧化石墨烯（PS/Au/GO）微针与微型化电化学信号转导系统相结合，通过CRISPR介导的二茂铁标记ssDNA报告基因的切割，实现了对细菌DNA的实时、高特异性传感。本研究为开发用于感染性疾病监测的即时、微创诊断工具提供了新策略。

　　

Section snippets（章节摘要）

Materials（材料）

关于材料的详细信息请参阅S1, 支持信息 (SI)。

Methods（方法）

关于方法的详细信息，包括PS/Au微针的制备、表面功能化与CRISPR系统组装、细菌培养与DNA提取、靶序列选择及PCR引物和crRNA设计、Cas12a介导的顺式切割（cis-cleavage）和反式切割（trans-cleavage）验证、PS/Au/GO微针的生物相容性评估、体内靶向捕获金黄色葡萄球菌DNA、以及通过CRISPR微针进行细菌原位检测的方法，详见支持信息。

Illustration of Sensing Mechanism of the Engineered CRISPR-Cas12a MNs（工程化CRISPR-Cas12a微针的传感机制示意图）

如图1所示，基于聚苯乙烯（PS）的微针依次修饰了金（Au）层和氧化石墨烯（GO），然后与CRISPR/Cas12a系统（包括Cas12a蛋白、向导crRNA和一种二茂铁标记的单链DNA（ssDNA）报告基因）进行偶联。由此产生的PS/Au/GO/CRISPR/Cas12a微针能够实现无需扩增的靶标DNA精确检测。一旦识别到靶标双链DNA（dsDNA），Cas12a即被激活，并切割靶标DNA和报告基因ssDNA。报告基因的切割导致其从微针表面释放，进而引起电化学信号（例如，电流或阻抗）的显著变化。这种信号变化可以通过便携式电化学读卡器进行测量，并通过智能手机界面直观显示，从而实现对目标细菌的快速、定量检测。

Conclusion（结论）

在本研究中，我们首次报道了一种便携式、CRISPR/Cas12a功能化的微针生物传感器，它能够直接从皮肤间质液中快速、原位、且无需核酸扩增地检测细菌DNA。通过将导电PS/Au/GO微针与CRISPR/Cas12a介导的切割反应和电化学信号转导相结合，该平台实现了适用于床旁应用的高灵敏度和高特异性检测。该系统成功检测到了低至4.27 × 10⁵ CFU/mL的细菌载量，这一灵敏度低于典型的临床阈值。该系统具有生物相容性好、微创性强等特点，能够有效获取间质液、捕获靶标并在1小时内产生可量化的电化学信号。结合便携式读卡器和智能手机界面，这种可穿戴系统为床旁诊断和个性化感染性疾病监测提供了一个用户友好的工具。