基于pH驱动法构建的超声预处理哈密瓜籽蛋白-姜黄素复合物：结构表征、功能特性及相互作用机制研究

《Current Research in Food Science》：Ultrasound-assisted phosphorylation cantaloupe seed protein isolate-curcumin complexes prepared by pH shift treatment: Structural and functional properties

本研究针对姜黄素(CUR)水溶性差、稳定性低等问题，通过pH驱动法构建超声预处理哈密瓜籽分离蛋白(UP-CSPI)与CUR的复合物(UP-CSPI-CUR)。研究发现，UP-CSPI能有效包封CUR(包封率最高达90.79%)，显著提升其热稳定性和抗氧化活性(DPPH和ABTS+自由基清除能力)，并改善蛋白质的乳化性能(EAI和ESI)。该复合物为开发新型植物蛋白基功能性食品载体提供了新策略。

　　

姜黄素(Curcumin, CUR)作为一种天然多酚类化合物，因其出色的抗氧化、抗炎等生物活性而备受关注。然而，CUR极差的水溶性和化学不稳定性严重限制了其在食品和医药领域的应用。如何提高CUR的生物利用度已成为当前研究的热点。蛋白质作为天然的生物大分子，因其两亲性和良好的生物相容性，常被用作疏水性活性物质的递送载体。哈密瓜籽是瓜果加工中的主要副产物，富含蛋白质，但其深加工和高值化利用研究相对较少。利用哈密瓜籽蛋白开发高效、安全的活性物质递送系统，不仅能提升CUR的应用价值，也为农产品副产物的综合利用开辟了新途径。

在此背景下，研究人员在《Current Research in Food Science》上发表论文，探讨了通过pH驱动法构建超声预处理哈密瓜籽分离蛋白(Ultrasonic Pretreated Cucumis melo Seed Protein Isolate, UP-CSPI)与姜黄素(CUR)的复合物(UP-CSPI-CUR)，并系统研究了其结构、稳定性、功能特性及相互作用机制。

为开展本研究，作者团队主要运用了几项关键技术。他们首先通过碱溶酸沉法从哈密瓜籽中提取蛋白质，并对其进行超声预处理(UP)。核心的复合物制备采用pH驱动法，即先在碱性条件下(pH 12.0)使蛋白质展开以暴露疏水区域，随后加入不同浓度的CUR，最后调节pH至中性(pH 7.0)使蛋白质复性并包埋CUR。对形成的UP-CSPI-CUR复合物，研究人员综合利用紫外-可见分光光度法测定包封率(Encapsulation Efficiency, EE)和负载量(Load Capacity, LC)；通过激光粒度分析仪和Zeta电位仪评估复合物的颗粒大小分布和稳定性；采用傅里叶变换红外光谱(Fourier Transform Infrared Spectroscopy, FT-IR)和荧光光谱分析蛋白质二级结构变化和相互作用机制；通过同步荧光和分子对接技术深入探究结合位点；并利用差示扫描量热法(Differential Scanning Calorimetry, DSC)和热重分析(Thermogravimetric Analysis, TGA)评价热稳定性。此外，还系统测定了复合物的乳化性(Emulsifying Activity Index, EAI; Emulsifying Stability Index, ESI)和抗氧化活性(DPPH和ABTS⁺自由基清除能力)。

Load capacity and Encapsulation rate分析

研究发现，随着CUR添加量从0.5 mg/mL增加至2.0 mg/mL，复合物的包封率从90.79%下降，而负载量则显著上升至11.67 g/100g蛋白质。当CUR浓度为0.5 mg/mL时，复合液呈现均一状态，包封效果最佳；而当浓度增至2.0 mg/mL时，溶液出现浑浊，表明有过量的CUR未被包封而发生自身聚集。

Particle Size Distribution and Zeta Potential分析

随着CUR浓度的增加，UP-CSPI-CUR复合物的粒径显著增大，尤其是在CUR浓度为2.0 mg/mL时，粒径最大，这与包封率下降的结果相互印证，表明过量CUR导致复合物聚集。另一方面，Zeta电位绝对值的增加表明CUR的引入增强了复合物颗粒间的静电排斥力，有助于体系的物理稳定性，但当CUR浓度过高时，静电排斥力的增强不足以克服疏水相互作用等引力，从而导致粒径增大。

Content of -SH and S-S groups与Surface Hydrophobicity (H₀)分析

复合物中游离巯基(-SH)和二硫键(S-S)的含量均随CUR浓度的增加而显著降低。这可能是由于CUR与蛋白质结合后，诱导蛋白质构象发生变化，使得原本暴露的巯基被埋藏于分子内部，同时部分二硫键在碱性环境下发生断裂。表面疏水性(H₀)的显著降低，则归因于CUR分子中的极性基团（如酚羟基）增加了蛋白质表面的亲水环境，从而削弱了蛋白质分子间的疏水相互作用。

FTIR和secondary structure分析

FTIR光谱显示，与CUR结合后，UP-CSPI的酰胺I带和酰胺II带吸收峰发生红移，表明CUR影响了蛋白质的构象。对酰胺I带（1700-1600 cm^-1）的二级结构分析表明，CUR的结合导致无规卷曲结构含量从25.85%降至13%-14%，而β-转角结构含量则从38.33%显著增加至45%-47%。这表明CUR与UP-CSPI的相互作用诱导了蛋白质二级结构的重排，使其结构更加紧密。

Fluorescence quenching与Thermodynamic Study分析

荧光猝灭实验表明，CUR对UP-CSPI的内源荧光具有显著的浓度依赖性猝灭效应，且最大发射波长发生蓝移，提示色氨酸等残基的微环境极性降低，疏水性增强。Stern-Volmer方程分析显示猝灭常数K_q远大于动态猝灭极限，表明猝灭机制为静态猝灭，即形成了基态复合物。结合常数K_a在10³数量级，结合位点数n接近1，表明二者以1:1的化学计量比结合。热力学参数（ΔH > 0, ΔS > 0）表明疏水相互作用是驱动复合物形成的主要力量，且整个过程是自发的(ΔG < 0)。

Synchronous Fluorescence Measurement分析

同步荧光光谱(Δλ = 15 nm和60 nm)显示，随着CUR的加入，酪氨酸和色氨酸残基的荧光强度均被猝灭，且最大发射波长发生变化，证实了这两种氨基酸残基参与了与CUR的相互作用，其微环境发生了改变。

Thermal stability分析

DSC和TGA分析结果表明，UP-CSPI-CUR复合物的热变性温度高于未添加CUR的UP-CSPI(125°C)，且热分解过程中的质量损失曲线也表明复合物具有更高的热稳定性。这说明CUR的结合起到了稳定蛋白质结构的作用。

SEM分析

扫描电镜结果显示，未添加CUR的UP-CSPI呈现不规则的大片层状结构，表面粗糙。而UP-CSPI-CUR复合物的片层结构减小，出现不规则多孔结构，且表面有CUR颗粒分布。这可能是由于CUR占据蛋白质表面疏水位点后，减少了蛋白质分子间的直接疏水聚集。

CUR Stability分析

稳定性实验证明，UP-CSPI的包封显著提高了CUR在不同温度（25°C和65°C）下的保留率。游离CUR在水溶液中降解迅速，而复合物中的CUR则得到了有效保护，显示了蛋白质载体在提高CUR稳定性方面的巨大优势。

EAI and ESI与Antioxidant Activity分析

功能特性研究表明，与CUR结合后，UP-CSPI的乳化活性指数(EAI)和乳化稳定性指数(ESI)均显著提升。同时，UP-CSPI-CUR复合物表现出比游离CUR更强的DPPH和ABTS⁺自由基清除能力。这可能是因为蛋白质包封改善了CUR的分散性，使其酚羟基能更有效地与自由基反应。

Molecular Docking分析

分子对接模拟显示，CUR分子能够嵌入到蛋白质（以同源性较高的南瓜籽球蛋白为模型）的疏水空腔中。相互作用分析表明，CUR与蛋白质残基（如TYR178, GLU187, GLY212等）之间主要存在氢键、范德华力以及疏水相互作用（如Pi-Pi堆积、Pi-烷基相互作用），从分子层面验证了二者结合的可行性。

本研究成功通过pH驱动法构建了UP-CSPI-CUR复合物。研究结论表明，UP-CSPI能有效包封CUR，且二者主要通过疏水相互作用和氢键以1:1的化学计量比自发结合。这种结合不仅显著提高了CUR的水溶性和化学稳定性，还改善了蛋白质载体本身的热稳定性和乳化性能。复合物展现出优于游离CUR的抗氧化活性。分子对接结果从原子层面揭示了结合位点和作用力类型。该研究为利用农产品加工副产物（哈密瓜籽）开发高性能的天然活性物质递送系统提供了理论依据和技术支持，在功能性食品、保健品及医药领域具有广阔的应用前景。然而，该研究目前仍处于实验室阶段，其规模化生产工艺、体内生物利用度及安全性评价等方面仍需进一步探索。