KCNJ14高表达与结直肠癌免疫抑制微环境及晚期病理特征的关联：基于RNA原位杂交的分析

《Experimental Eye Research》：High KCNJ14 expression is associated with an immunosuppressive tumor microenvironment and advanced pathological features: An RNA in situ hybridization-based analysis of colorectal carcinoma

本研究针对结直肠癌(CRC)缺乏可靠生物标志物预测肿瘤进展和免疫微环境的临床难题，通过RNA原位杂交(RNA-ISH)技术分析259例CRC组织芯片，首次发现KCNJ14高表达与淋巴管浸润、静脉浸润、淋巴结转移及晚期TNM分期显著相关，且与CD4+/CD8+ T细胞浸润减少及TIL评分降低密切相关，提示KCNJ14可作为免疫抑制性肿瘤微环境(TME)的潜在指标和治疗靶点。

　　

在当今全球癌症负担日益加重的背景下，结直肠癌(Colorectal Carcinoma, CRC)作为消化系统最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率始终居高不下。尽管手术技术、化疗方案及免疫治疗手段不断进步，但晚期患者的预后依然较差，尤其对于发生复发或转移的病例，个体差异显著。传统TNM分期系统虽能提供基础预后信息，却难以全面反映肿瘤的生物学特性及微环境状态。因此，寻找能够精准预测肿瘤进展和免疫微环境的新型分子标志物成为临床实践的迫切需求。

近年来，离子通道蛋白在肿瘤发生发展中的作用逐渐受到关注。钾离子通道家族成员KCNJ14（又称Kir2.4）作为一种内向整流钾通道，其编码基因位于19号染色体。既往生物信息学分析提示，KCNJ14在多种恶性肿瘤中，尤其是胃肠道癌中存在过表达，并与肿瘤进展、mTOR信号通路激活以及免疫抑制性肿瘤微环境(Tumor Microenvironment, TME)的形成相关。然而，这些发现多基于大规模测序数据库的间接分析，缺乏在真实患者组织标本中直接验证KCNJ14表达的空间分布及其与病理特征关联的研究。

为了填补这一空白，由Hiroshi Sawaguchi和Takeshi Uehara等研究人员组成的团队在《Experimental Eye Research》上发表了他们的最新研究成果。他们创新性地运用RNA原位杂交(RNA in situ hybridization, RNA-ISH)技术，结合组织微阵列(Tissue Microarray, TMA)平台，对259例结直肠癌手术标本进行了KCNJ14 mRNA表达的精准定位和定量分析，并深入探讨了其与一系列临床病理参数、肿瘤浸润免疫细胞（包括CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞和FOXP3⁺调节性T细胞）密度以及患者预后的相关性。此外，研究还利用公共单细胞RNA测序(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)数据进一步验证了KCNJ14的细胞来源。这项研究首次在组织学层面直观揭示了KCNJ14在结直肠癌中的表达模式，为理解该分子在肿瘤生物学中的作用提供了新的视角。

研究人员主要采用了以下几种关键技术方法：首先，他们构建了包含259例来自信州大学医院2014年至2022年手术切除的CRC样本的组织微阵列(TMA)。其次，利用RNAscope技术进行RNA原位杂交(RNA-ISH)，特异性检测KCNJ14 mRNA在肿瘤细胞中的表达水平并进行半定量评分。第三，通过免疫组织化学(Immunohistochemistry, IHC)染色定量分析肿瘤核心区域CD4⁺、CD8⁺和FOXP3⁺淋巴细胞的浸润情况。第四，借助公开可用的单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据集(GSE132465)分析KCNJ14在不同细胞类型中的表达分布。最后，应用统计学方法（如Fisher精确检验、Mann-Whitney U检验、Kaplan-Meier生存分析和Cox回归模型）评估KCNJ14表达与各临床病理变量及生存结局的关联。

3.1. High KCNJ14 expression correlates with advanced pathological features and an immunosuppressive tumor microenvironment

研究结果显示，KCNJ14阳性信号表现为癌细胞核和胞质中的棕色点状斑点。在259例CRC病例中，115例检测到KCNJ14表达，其中36例（13.9%）被定义为高表达（评分≥2+）。值得注意的是，正常结肠黏膜中未检测到KCNJ14信号。统计分析揭示，与KCNJ14低表达组相比，高表达组呈现出显著更高的淋巴管浸润、静脉浸润、淋巴结转移以及晚期（III-IV期）TNM分期的发生率。更重要的是，从免疫微环境角度看，KCNJ14高表达与显著降低的肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor-Infiltrating Lymphocytes, TILs)评分、减少的CD4⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞浸润密度相关，而FOXP3⁺细胞浸润则无显著差异。这些数据强烈提示KCNJ14高表达与更具侵袭性的肿瘤表型和“免疫冷”型（即T细胞排斥型）免疫抑制微环境密切相关。

3.2. KCNJ14 expression shows no significant impact on overall survival or recurrence-free survival

尽管KCNJ14高表达与不良病理特征相关，但生存分析显示，其与患者的总生存期(Overall Survival, OS)或无复发生存期(Recurrence-Free Survival, RFS)均无统计学显著关联。单变量Cox比例风险回归分析进一步证实了这一点，KCNJ14表达水平并非独立的预后因素。

3.3. KCNJ14 is predominantly expressed in epithelial tumor cell clusters according to single-cell RNA sequencing analysis

为了明确KCNJ14表达的细胞来源，研究人员对公共scRNA-seq数据进行了分析。结果发现，KCNJ14表达主要富集于肿瘤组织中的上皮细胞（即癌细胞）簇，而在免疫细胞（T细胞、B细胞、肥大细胞、髓系细胞）和基质细胞中几乎不表达。在正常组织中，KCNJ14表达水平普遍极低。这一发现与RNA-ISH观察到的癌细胞特异性表达模式高度一致，进一步确认了KCNJ14是肿瘤细胞本身表达的分子，而非浸润免疫细胞所带来。

综上所述，本研究通过严谨的实验设计和高特异性的技术手段，首次在组织原位水平证实了KCNJ14在结直肠癌中的表达特征及其临床意义。研究结论明确指出，KCNJ14的高表达与结直肠癌的晚期病理特征（如淋巴管/静脉浸润、淋巴结转移、晚期分期）和免疫抑制性肿瘤微环境（表现为CD4⁺/CD8⁺ T细胞浸润减少和TIL评分降低）显著相关。虽然KCNJ14本身在本研究队列中并非独立的预后预测因子，但其作为塑造“免疫冷”表型的关键分子指标的价值不容忽视。

在讨论部分，作者深入分析了可能的机制。KCNJ14可能通过激活mTOR通路、血管内皮生长因子信号等途径，间接影响肿瘤细胞的生物学行为及其与微环境的相互作用，从而导致T细胞排斥和免疫抑制状态。这种特性使得KCNJ14有望成为预测免疫治疗抵抗的潜在生物标志物。尽管存在回顾性研究、单中心样本、相对较短随访时间以及未能进行蛋白水平验证等局限性，但本研究成功地将生物信息学预测与临床病理分析相结合，为KCNJ14的功能研究和未来的临床转化提供了坚实的理论基础。最终，该研究强调了KCNJ14在结直肠癌肿瘤微环境调控中的重要作用，为其作为新的治疗靶点和联合治疗策略的开发指明了方向。