miR-ON-CRISPR：基于microRNA激活的CRISPR-dCas9系统在脓毒症基因治疗中的精准调控与应用

《Nucleic Acids Research》：MiR-ON-CRISPR: a microRNA-activated CRISPR–dCas9 system for precise gene therapy in living cells and mouse models of sepsis

本研究针对CRISPR-dCas9系统在基因治疗中存在的脱靶效应和细胞特异性不足等问题，开发了一种新型microRNA激活的CRISPR-dCas9双调控系统（miR-ON-CRISPR）。该系统通过内源性miRNA同时调控dCas9和sgRNA的表达，实现了对靶基因的精准激活。研究证实该系统可实时监测神经细胞分化状态，构建AND/OR逻辑门检测多重miRNA，并通过激活外源DTA基因或内源BAX基因实现细胞特异性杀伤。在脓毒症小鼠模型中，该系统通过激活Nrf2基因有效缓解了肝损伤、氧化应激和内质网应激。该研究为基因治疗提供了新的精准调控工具，具有重要的临床应用前景。

基因编辑技术的快速发展为疾病治疗带来了革命性突破，其中CRISPR-dCas9系统因其能够精准调控基因表达而备受关注。然而，传统的CRISPR系统存在明显的局限性：一方面，其活性难以精确控制，容易产生脱靶效应；另一方面，缺乏细胞特异性使得其在复杂生物环境中的应用受到限制。这些问题的存在严重制约了CRISPR技术在临床治疗中的安全性和有效性。

为了突破这些技术瓶颈，西安交通大学的研究团队在《Nucleic Acids Research》上发表了一项创新性研究，开发了一种名为miR-ON-CRISPR的新型基因调控系统。该系统巧妙利用内源性microRNA（miRNA）作为分子开关，实现了对CRISPR-dCas9系统的双重调控，为精准基因治疗提供了新的技术平台。

研究人员采用模块化设计思路，构建了一个包含三个核心组件的调控系统：表达LacI和pre-sgRNA的质粒、表达LacO₂-dCas9-VPR的质粒以及含有报告基因的TRE-GOI质粒。该系统的工作原理十分精巧：在目标miRNA缺失的情况下，功能性sgRNA无法产生，同时LacI蛋白会抑制dCas9-VPR的表达，从而最大限度地降低系统的泄漏活性。而当目标miRNA存在时，miRNA通过结合靶位点介导LacI mRNA的降解，解除对dCas9-VPR的抑制，同时释放出功能性sgRNA，最终激活靶基因的表达。

主要技术方法

本研究采用分子克隆技术构建了miR-ON-CRISPR系统所需的各种质粒载体。通过细胞转染实验在HEK-293、HeLa、HCT-116和P19等多种细胞系中验证系统功能。利用荧光素酶报告基因检测系统活性，流式细胞术分析细胞凋亡，实时定量PCR（RT-qPCR）检测基因表达。建立LPS诱导的脓毒症小鼠模型，通过ELISA检测细胞因子水平，生化分析检测肝功能指标，组织染色观察病理变化。

系统设计与表征

研究团队首先分别构建了miRNA激活的dCas9系统（miR-ON-dCas9）和miRNA激活的sgRNA系统（miR-ON-sgRNA）。实验结果表明，这两种单调控系统均能响应特定的miRNA信号，但存在一定的泄漏表达。在此基础上，研究人员将两种调控机制整合，开发了双重调控的miR-ON-CRISPR系统。

通过系统的功能验证，miR-ON-CRISPR系统展现出优异的性能：仅对目标miRNA产生特异性响应，且泄漏活性显著低于单调控系统。研究人员还验证了该系统在不同细胞类型中的普适性，包括难以转染的C2C12成肌细胞，证明其具有良好的应用前景。

监测神经细胞分化

为了展示系统的实际应用价值，研究人员利用P19神经细胞分化模型，验证了miR-ON-CRISPR系统监测miR-124表达的能力。随着神经细胞分化进程的推进，系统中荧光素酶活性逐渐增强，成功实现了对细胞分化状态的实时成像。这一应用为研究细胞分化过程提供了新的技术手段。

逻辑门电路设计

考虑到复杂生物环境中往往需要整合多个miRNA信号，研究团队进一步开发了"OR/AND门控"miR-ON-CRISPR系统。通过将不同miRNA的响应模块 strategically地放置在LacI基因的5'-UTR和3'-UTR区域，成功构建了能够同时检测两种miRNA的逻辑门系统。这种设计大大增强了系统在复杂生物环境中的适用性。

细胞特异性杀伤应用

在功能应用方面，研究人员设计了能够激活外源DTA基因或内源BAX基因的miR-ON-CRISPR系统。实验结果表明，在表达高水平miR-21的HeLa和HCT-116细胞中，系统能够有效诱导细胞凋亡，而在不表达miR-21的HEK-293细胞中则不会引起明显的细胞毒性。这一应用为肿瘤等疾病的特异性治疗提供了新的思路。

脓毒症治疗应用

最后，研究团队在LPS诱导的脓毒症小鼠模型中验证了系统的治疗潜力。通过构建miR-155激活的Nrf2表达系统（miR155-ON-Nrf2），研究人员发现该系统能够有效缓解脓毒症引起的肝损伤。机制研究表明，Nrf2的激活能够上调抗氧化酶基因（NQO1、GCLM、HO-1）的表达，降低氧化应激水平，减轻内质网应激和肝细胞凋亡。

研究结论与意义

本研究开发的miR-ON-CRISPR系统代表了一种新型的基因调控工具，其双重调控机制确保了系统的高度特异性和低背景噪音。该系统不仅能够精确监测miRNA表达和细胞状态变化，还能实现细胞特异性的基因调控和治疗干预。在脓毒症治疗中的应用验证了其在疾病治疗中的巨大潜力。

该研究的创新之处在于将内源性miRNA信号与CRISPR技术有机结合，实现了对基因表达的多层次精准调控。这种模块化、可编程的设计思路为后续研究提供了重要借鉴。虽然目前系统仅能响应1-2种miRNA，但其技术框架为开发更复杂的多信号响应系统奠定了基础。

未来，随着载体技术的进步和组织特异性启动子的优化，miR-ON-CRISPR系统有望在更多疾病模型中展现其治疗价值。特别是对于癌症、遗传性疾病等需要精准治疗的领域，这种能够根据细胞内在特征自动激活的治疗系统具有独特的优势。该研究为基因治疗领域的发展提供了新的技术路径和思路，具有重要的科学意义和临床应用前景。