蛋白酶协同非热超声与微波技术提升干豆淀粉提取率及功能特性的绿色策略

《International Journal of Biological Macromolecules》：Combining proteolytic enzyme with non-thermal ultrasound and microwave methods for enhanced extractability and modified functionality of dry bean ( Phaseolus vulgaris) starch: A chemical-free strategy

本研究针对传统碱性提取法存在的环境污染问题，开发了一种蛋白酶辅助结合超声/微波的绿色提取策略。结果表明，0.5%蛋白酶提取效果与碱法相当（回收率~84%），而联合超声/微波可在更低酶用量下实现更高回收率（~87%），并显著改变淀粉功能特性（如消化性、糊化特性等），为无需化学修饰制备特定应用淀粉提供了新途径。

　　

淀粉作为重要的工业原料，在食品、纺织、包装和制药等领域发挥着关键作用。传统上，谷物、块根和块茎是商业淀粉的主要来源，但豆类也含有高达55%的淀粉含量。加拿大作为全球最大的豆类生产国和出口国之一，对豆类淀粉进行高附加值开发具有重要的经济意义。其中，干豆是加拿大最大的出口类别，斑豆约占干豆出口的40%。因此，本研究选择斑豆作为模型豆类。

然而，当前工业上豆类淀粉的提取主要依赖于干法分馏，这种方法通常导致淀粉纯度较低。虽然湿法提取被证明可以获得高纯度淀粉（>92%），但通常涉及使用碱性或盐溶液，引发了废水产生和环境可持续性的担忧。此外，豆类富含蛋白质，其中高达70%是水不溶性的，这需要化学溶剂并使得高效分离复杂化。因此，开发环境友好的湿法提取技术，确保有效的蛋白质去除和高淀粉回收率，需求日益增长。

酶在食品工业中因其高效、经济和环境可持续性而广泛应用。蛋白酶为高效水解和去除蛋白质提供了一种有前景的解决方案，从而有助于提取高纯度淀粉。此外，提取的淀粉通常需要经过改性过程，以调整其特性满足特定的工业应用。在提取过程中整合不同的加工技术可以增强淀粉回收率和功能特性。超声波和微波辅助方法是两种这样的方法，它们已被有效地独立或联合用于淀粉提取和改性。

在此背景下，研究人员在《International Journal of Biological Macromolecules》上发表了题为“Combining proteolytic enzyme with non-thermal ultrasound and microwave methods for enhanced extractability and modified functionality of dry bean (Phaseolus vulgaris) starch: A chemical-free strategy”的研究论文，旨在探索一种化学free的策略来改进豆类淀粉的提取和功能。

为开展本研究，研究人员采用了以下主要关键技术方法：以加拿大安大略省Hensall Coop提供的干斑豆为原料，制备全豆粉；使用食品级蛋白酶（ALPE 200）进行酶法提取；采用探头式超声波仪（20 kHz）和家用微波炉（2.45 GHz）作为物理辅助手段；通过离心、洗涤和分段干燥（45°C和85°C）回收淀粉；使用总淀粉测定试剂盒、LECO FP828蛋白质分析仪、扫描电子显微镜（SEM）、差示扫描量热仪（DSC）、快速粘度分析仪（RVA）、流变仪、X射线衍射仪（XRD）以及体外消化性分析等对淀粉的得率、纯度、形貌、热特性、糊化特性、流流变特性、结晶结构和消化性进行了系统表征。

3.1. 淀粉提取

研究人员比较了不同提取方法对淀粉得率、纯度和回收率的影响。结果表明，仅使用蛋白酶时，淀粉回收率随酶浓度增加而显著提高，在0.5%浓度时达到约84%，与常规碱法（对照）相当。当酶提取与超声波预处理结合时，即使在0.1%的低酶浓度下，淀粉回收率也显著提高至约87%，且淀粉纯度高达约98%。微波辅助酶提取也显示出类似趋势，在0.25%-0.5%酶浓度下获得最佳提取效果。这表明超声波和微波的物理力能够破坏淀粉-蛋白质基质，增强蛋白酶的可及性，从而在更低酶用量下实现高效提取。超声波单独处理也能部分去除蛋白质，提高淀粉回收率，证实了其物理剥离作用。

3.2. 淀粉表征

3.2.1. 淀粉损伤

超声波辅助提取（US+E）的淀粉损伤值（1.40%）显著高于其他方法（0.48%-0.71%），这归因于超声波空化产生的剪切力和微射流对淀粉颗粒的物理破坏。酶单独处理（E）、微波辅助提取（MW+E）和碱法（对照）的损伤值较低，表明其主要损伤来源于制粉和过筛步骤。

3.2.2. 表面形态

所有方法提取的淀粉颗粒均呈椭圆形、球形或肾形。超声波处理（US+E）的淀粉颗粒表面出现凹痕、坑洞、孔隙、表面裂纹和破碎颗粒，表明超声波引起了明显的表面损伤。其他方法提取的淀粉表面相对光滑，损伤较小。

3.2.3. 表观直链淀粉含量

超声波辅助提取（US+E）的淀粉表观直链淀粉含量最高（41.97%），显著高于其他方法（约32.68%-33.35%）。这表明超声波可能引起了淀粉颗粒内支链淀粉的脱支作用，释放出更多的线性链，从而增加了测得的直链淀粉含量。微波处理和酶单独处理对直链淀粉含量无显著影响。

3.2.4. 糊化特性

超声波辅助提取（US+E）淀粉的起始糊化温度（T₀ = 45.51°C）显著降低，糊化焓（ΔH_G = 12.85 J/g）也显著低于其他方法，表明超声波处理破坏了淀粉的结晶结构，使其更易糊化，但糊化过程所需的整体能量降低。其糊化温度范围（ΔT = T_c-T₀）更宽，表明糊化过程中淀粉颗粒的异质性增加。微波辅助提取（MW+E）和酶单独提取（E）的糊化特性与碱法对照无显著差异。

3.2.5. 回生和脱水收缩

在4°C储存期间，所有淀粉凝胶的回生程度（以回生焓和回生百分比表示）和脱水收缩（析水率）均随时间延长而增加。超声波辅助提取（US+E）淀粉的回生百分比和脱水收缩值在储存第3天和第5天均显著高于其他方法，表明其直链淀粉和支链淀粉链的重组倾向更强。这与其较高的直链淀粉含量和超声波可能导致的支链淀粉结构松动有关。

3.2.6. 溶胀力和溶解度

淀粉的溶胀力和溶解度随温度（50-90°C）升高而增加。在所有温度下，超声波辅助提取（US+E）淀粉的溶胀力和溶解度均最高，其次是微波辅助提取（MW+E）、酶单独提取（E）和碱法对照。这表明超声波处理增加了淀粉颗粒的无定形区域和可及性，促进了水分的吸收和淀粉分子的溶出。

3.2.7. 糊化行为

快速粘度分析显示，超声波辅助提取（US+E）淀粉的峰值粘度（PV）、崩解值（BV）、最终粘度（FV）和回值（SV）均最高，表明其糊化过程中粘度发展更显著，但糊液稳定性相对较差（较高BV），冷却后重组程度更高（较高FV和SV）。微波辅助提取（MW+E）也显示出类似的趋势，但程度较轻。酶单独提取（E）与碱法对照的糊化特性无显著差异。糊化温度（PT）在US+E和MW+E中略有降低。

3.2.8. 流变特性

所有淀粉凝胶均表现出剪切稀化行为（非牛顿流体特性）。超声波辅助提取（US+E）和微波辅助提取（MW+E）淀粉凝胶的稠度指数（k）较高，流动行为指数（n）较低，表明其凝胶结构更强，但对外部剪切的依赖性更大。动态流变分析表明，所有凝胶均表现为弹性固体（G′ > G″）。US+E和MW+E的储能模量（G′）高于E和对照，损耗模量（G″）较低，进一步证实了物理辅助处理增强了淀粉凝胶的强度。

3.2.9. 结晶度

X射线衍射显示所有淀粉样品均呈现C_A型结晶图谱。超声波辅助提取（US+E）淀粉的相对结晶度最低，表明超声波有效破坏了淀粉的结晶区域。微波辅助提取（MW+E）淀粉的结晶度也有所降低，但程度不及超声波。酶单独提取（E）和碱法对照的结晶度最高且无显著差异。

3.2.10. 体外消化性

超声波辅助提取（US+E）淀粉的快速消化淀粉（RDS）含量和总消化淀粉（TDS）含量最高，抗性淀粉（RS）含量最低，表明其更易被酶解。慢速消化淀粉（SDS）含量在US+E中也最高。水解动力学符合一级模型，US+E的水解速率常数（k）和最终水解程度（C_∞）均最高，其估算血糖生成指数（eGI）也显著高于其他方法（US+E: 62.21; E: 56.34; MW+E: 56.85; 对照: 56.38）。微波辅助提取（MW+E）对消化性的影响小于超声波。

本研究得出结论，蛋白酶辅助提取法是一种可行的、化学free的替代传统碱法的方法，可获得相当的淀粉提取效果。与超声波或微波预处理相结合，不仅能进一步降低酶用量、提高淀粉回收率，还能同时改性淀粉功能特性。超声波处理能显著改变淀粉的多项功能性质（如提高消化性、改善凝胶强度等），而低功率微波处理则主要增强凝胶强度并降低结晶度。这些改性使得所得淀粉可能适用于特定领域，如需要高溶解度、高重组倾向或快速消化的食品体系，以及生物可降解包装材料。这种集成方法有望在生产特定应用淀粉的同时，省去后续改性步骤，从而可能抵消物理处理带来的额外成本。需要注意的是，本研究结果基于特定来源的斑豆和特定活性的蛋白酶（Bacillus licheniformis来源，200,000 U/g），不同豆类品种和酶制剂可能需要调整优化工艺参数。