CRISPR/Cas9介导的蛋白捕获文库：人类与小鼠细胞系靶向敲入图谱构建与资源平台开发

《Nucleic Acids Research》：The knock-in atlas: a web resource for targeted protein trap by CRISPR/Cas9 in human and mouse cell lines

本研究针对CRISPR/Cas9介导的基因敲入技术在大规模应用中存在的gRNA设计优化、蛋白结构干扰规避及细胞系适配性等挑战，开发了“Knock-in Atlas”网络资源平台。研究团队通过系统筛选人类和小鼠基因组内含子靶点，整合gRNA切割效率评分、AlphaFold2蛋白结构预测及基因表达水平数据，成功构建了350个荧光蛋白标记的细胞系，并验证了其蛋白定位与功能可靠性。该平台为规模化蛋白质功能研究提供了高效、可重复的技术方案，显著降低了基因敲入实验的门槛。

　　

研究背景与挑战

随着CRISPR/Cas9技术的快速发展，基因编辑已成为生命科学研究的核心工具。然而，大规模基因敲入（Knock-in）技术的应用仍面临多重瓶颈：其一，传统的同源定向修复（HDR）策略需为每个靶基因定制供体DNA，成本高昂且操作繁琐；其二，非同源末端连接（NHEJ）介导的敲入虽简化了供体设计，但易因插入突变影响蛋白功能；其三，现有资源库多局限于特定细胞类型（如HEK293T），缺乏跨物种、多细胞系的标准化方案。此外，gRNA设计需兼顾切割效率、靶点特异性及避免破坏蛋白结构域，这对大规模筛选提出了严峻挑战。

关键技术方法

为突破上述限制，研究团队开发了基于NHEJ的敲入策略，通过将包含荧光蛋白Venus的人工外显子插入目标基因内含子，实现内源蛋白标记。关键技术包括：（1）利用CHOPCHOP工具预测人类和小鼠基因组内含子靶点的gRNA，结合Doench评分筛选高效且特异性高的gRNA；（2）通过AlphaFold2预测蛋白局部结构（pLDDT评分），规避刚性结构区域；（3）优化供体DNA形式（质粒/PCR产物），并测试5′端化学修饰（如C6-PEG10）以提升敲入效率；（4）在HEK293T、eHAP1、HeLa、THP-1、Neuro2a、MEF和mESC等多种细胞中验证方案普适性。

研究结果

供体DNA形式优化

研究比较了质粒与5′端修饰PCR产物作为供体的效率。在HNRNPA1基因内含子1的敲入实验中，质粒供体产生约1.5%的Venus阳性细胞，而C6修饰的PCR产物将效率提升至6%以上，且显著减少假阳性信号。跨细胞系测试表明，修饰PCR产物在HeLa、eHAP1等细胞中均有效，但效率因细胞类型而异（附图S4）。

gRNA设计策略

团队建立了系统化gRNA筛选流程：首先基于MANE v1.0（人类）和RefSeq Select（小鼠）数据库选定代表性转录本，排除距离外显子-内含子交界75 nt内的区域以保障剪接效率；其次，通过AlphaFold2映射pLDDT评分至基因组，筛选pLDDT<80的柔性区域作为插入位点；最后，结合基因表达量（TPM>45）进一步优化靶点选择。该策略最终覆盖人类16,362个基因的142,862个内含子及小鼠17,398个基因的149,561个内含子（附图2）。

平台功能与验证

Knock-in Atlas网站（https://rnabio.naist.jp/atlas/）提供三大核心功能：（1）已构建细胞系的实验数据（流式细胞术、显微成像、Western blot）；（2）人类与小鼠gRNA数据库，支持按基因符号、表达量及pLDDT阈值筛选；（3）UCSC基因组浏览器嵌入式可视化（图4）。与Human Protein Atlas数据库对比显示，93%的敲入细胞系（308/335）蛋白定位一致；异常案例（如RACK1）经多克隆验证确认可靠性（附图S9）。Western blot与免疫共沉淀（Co-IP）实验进一步证实Venus标签蛋白的分子量正确性与生化应用潜力（图5B-D）。

结论与意义

本研究通过整合多组学数据与实验优化，构建了首个跨物种、多细胞系的CRISPR/Cas9敲入资源平台。其创新性体现在：（1）提出基于蛋白结构预测的靶点选择原则，显著降低标签插入对功能的影响；（2）开发模块化供体设计策略，支持荧光蛋白、表位标签等多种应用场景；（3）提供开源数据库与可视化工具，推动规模化蛋白质功能研究。与OpenCell、vpCells等现有资源相比，该平台独特覆盖239个高表达RNA结合蛋白（RBP），且93个为独有资源（图5E-F），为疾病机制探索与药物靶点验证提供了重要工具。论文发表于《Nucleic Acids Research》，标志着基因组编辑资源库建设迈向标准化、可及性新阶段。