40个新基因组揭示微孢子虫有性生殖与四倍体起源的奥秘

《PLOS Biology》：Forty new genomes shed light on sexual reproduction and the origin of tetraploidy in Microsporidia

本研究通过分析40个新获得的微孢子虫基因组（其中32个为完整基因组，8个达到染色体水平），揭示了微孢子虫中存在同源四倍体（autopolyploidy）以及基因组间重组的证据。Hi-C数据表明四倍体基因组被组织成两个二倍体单元（diploid units），类似于真菌的双核细胞（dikaryon），并存在单元内和单元间的重组信号。研究结果支持微孢子虫存在有性生殖周期（sexual cycle），并提出其生命周期模型与真菌繁殖模式相似，为理解这类重要寄生虫的生物学和进化提供了新见解。

　　

四十个新的微孢子虫基因组组装

研究团队通过筛选达尔文生命之树计划（Darwin Tree of Life, DToL）测序的宿主基因组数据，成功分离并组装了40个新的微孢子虫基因组。其中32个为完整基因组（BUSCO完整性 >70%），包含8个染色体水平的组装，其中7个是首次利用Hi-C数据辅助搭建的微孢子虫基因组。此外，还获得了8个部分基因组序列。这些基因组来源于八个昆虫目的宿主，涵盖了目前已描述的微孢子虫多样性的大部分范围，属于Bojko等人划分的七个主要微孢子虫分支中的五个。这些新基因组的质量和连续性大多优于或相当于已发表的微孢子虫基因组。研究团队还利用基因组测深和k-mer频谱分析（GenomeScope2, Smudgeplot）对其中19个基因组的倍性进行了评估，确定14个为多倍体（主要为四倍体），5个为二倍体。

系统发育分析与物种界定

基于600个保守的BUSCO基因构建的系统发育树，对微孢子虫的系统发育关系进行了修订，例如确认了新派里济目（Neopereziida）是诺斯玛目（Nosematida）和肠上皮细胞虫目（Enterocytozoonida）共同祖先的姐妹群。研究还利用已知物种基因组间的分支长度差异，建立了基于基因组数据的物种界定阈值。通过比较四倍体基因组内部同源亚基因组之间的分化程度，发现大多数情况下同源基因对的分化距离小于相同物种的界定阈值，支持这些四倍体为同源四倍体（autopolyploidy）而非异源四倍体（allotetraploidy）。研究还识别出五个新的物种级操作分类单元（OTU）。

四倍体起源与重组信号

为了探究微孢子虫中四倍体是古老的共享事件还是近期独立事件，研究人员对多拷贝BUSCO基因树进行了拓扑结构检验（Approximately Unbiased test）。结果表明，所有四倍体基因组的同源亚基因组其最近的共祖时间均晚于物种分化时间，即同源序列的共祖发生在物种形成之后。这一模式与近期独立的四倍化事件相符，但在存在同源序列间重组的情况下，古老的共享四倍体事件也可能被掩盖而呈现此模式。在多个高连续性的四倍体基因组中，观察到同源染色体间呈现嵌合式的相似性模式，以及染色体末端存在基因组组装塌陷的区域，这些都被解释为近期同源重组的信号。

四倍体细胞的二倍体单元结构

研究人员利用对一个四倍体基因组（iuLoeVari1.μ）的Hi-C数据分析，揭示了其三维基因组结构。分析显示，每条染色体的四个同源拷贝呈现出“二加二”的关联模式，即整个基因组可以清晰地划分为两个二倍体单元，每个单元包含20条染色体。这种结构与微孢子虫中常见的双核体（diplokaryon）形态相对应，提示每个二倍体单元可能对应一个细胞核，即四倍体细胞包含两个二倍体核。同时，之前观察到的重组信号也发生在这两个单元的内部和之间。

二倍体谱系中缺乏再二倍化证据

为了检验二倍体微孢子虫谱系是否源自古老的祖先四倍体状态并经历了再二倍化（rediploidisation），研究人员分析了二倍体基因组中重复基因（推测为旁系同源基因）的同义替换距离（Ks）分布。再二倍化过程通常会在Ks分布上留下一个特定年龄的峰值。然而，在所有分析的二倍体基因组中，均未发现此类峰值，表明没有检测到近期再二倍化事件的信号。这意味着观察到的二倍体谱系要么从未经历过四倍体阶段，要么其再二倍化是通过类似减数分裂还原或继承双核体中的一个核这种一步式机制完成的，而非通过基因丢失或功能分化的渐进式过程。

基因组内和基因组间的重排

研究发现，一些四倍体基因组中存在同源亚基因组间的大规模重排，包括倒位、融合、断裂和易位，导致单倍体亚基因组间基因含量不均。通过一种贪婪算法对四倍体基因组进行分箱（binning）分析，证实了这种重排和不均匀性的存在。此外，通过比较染色体水平组装的基因共线性，发现不同微孢子虫类群间的基因组重排速率非常高，以至于难以可靠地重建祖先的连锁群。

讨论与模型提出

综合所有发现，研究团队提出了一个微孢子虫生命周期的模型。该模型认为，在双核体阶段，每个细胞核是二倍体，因此整个细胞为四倍体。微孢子虫可能进行有性生殖，其过程类似于真菌，包括质配（plasmogamy）、核配（karyogamy）和稳定的“异核体”阶段（即双核体）。在这个模型中，二倍体和四倍体都可以作为具有有丝分裂能力的感染源。四倍体融合后，染色体需要被识别并正确分离到二倍体子核中。该模型预测，所有四倍体微孢子虫都应存在二倍体的“配子”形态，而已描述的二倍体谱系也可能存在四倍体形态。研究指出，虽然大多数二倍体物种是单核的，大多数四倍体物种是双核的，但仍存在例外，这可能与具有复杂生活史和多孢子类型的物种多态性有关。

这项研究通过生成大量高质量的微孢子虫基因组资源，提供了支持其存在有性生殖和同源四倍体的证据，并提出了一个整合了倍性、生殖和生命周期的统一模型，为未来深入研究这类独特且重要的寄生生物的进化生物学奠定了基础。