用于微小RNA检测的肽核酸探针：Mg2+离子效应、表面杂交及表面等离子体共振生物传感技术

《ACS Measurement Science Au》：Peptide Nucleic Acid Probes for MicroRNA Detection: Mg2+ Ion Effect, Surface Hybridization, and Surface Plasmon Resonance Biosensing

表面等离子体共振（SPR）传感器中Mg2?离子浓度对PNA探针与miRNA杂交效率的影响及机制研究。

　　在生物医学研究和临床诊断中，微小RNA（miRNA）作为一种重要的生物标志物，因其在细胞信号传导、基因表达调控以及多种疾病（如癌症）中的关键作用而受到广泛关注。miRNA的检测对于理解疾病机制、开发新型诊断工具以及探索治疗策略具有重要意义。然而，由于miRNA的分子量较小、序列相似性高以及在生物体液中浓度较低，其检测面临诸多挑战。为了解决这些问题，科学家们不断探索新的技术手段，其中基于表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）的核酸生物传感器因其高灵敏度、高特异性和无需标记的优点而备受青睐。PNA（肽核酸）作为一类具有独特物理化学特性的核酸模拟物，因其在生物环境中的稳定性以及对DNA和RNA的高效结合能力，被广泛应用于核酸生物传感领域。本文的研究重点在于探讨镁离子（Mg2?）对表面固定PNA探针与miRNA靶标之间的杂交过程的影响，为优化miRNA生物传感器的性能提供理论依据和实验支持。

### PNA的特性与应用前景

PNA是由中性聚酰胺骨架构成的合成分子，其结构与天然核酸类似，但具有更高的稳定性和更强的结合能力。与DNA或RNA不同，PNA不受酶降解的影响，且在低盐条件下仍能保持较高的杂交效率。PNA与DNA或RNA形成的异二聚体具有良好的热稳定性，这使其在复杂生物样本中仍能有效识别互补的基因序列。因此，PNA在基因分型、病原体检测以及疾病相关DNA表达谱的监测中具有广阔的应用前景。特别是在miRNA检测中，PNA因其与RNA的高亲和力而成为一种极具潜力的探针材料。

miRNA是RNA分子中的一类非编码小分子，通常长度在18-25个核苷酸之间。它们通过与靶标mRNA的结合，调控基因表达，因此在癌症、免疫疾病和神经系统疾病等复杂病理过程中发挥重要作用。然而，miRNA的检测面临多重挑战，包括其低浓度、高序列相似性以及易受RNA二级结构影响等。因此，需要开发高灵敏度和高特异性的检测方法。SPR技术作为一种无标记、实时监测分子间相互作用的工具，能够有效检测miRNA与PNA探针之间的结合过程，同时支持多靶点并行检测。这一特性使得SPR在miRNA检测中具有独特优势。

### Mg2?对PNA–miRNA杂交的影响

本研究通过表面等离子共振成像（SPR Imaging, SPRI）技术，系统评估了不同浓度的Mg2?和Na?对miRNA与表面固定PNA探针之间杂交过程的影响。实验结果表明，Mg2?在适当浓度下（30至100 mM）显著提升了miRNA与PNA探针的杂交效率，而Na?则未能达到类似效果。这种差异可能与Mg2?对miRNA分子的电荷屏蔽作用有关。miRNA分子带有负电荷，而Mg2?作为二价阳离子，能够有效中和这些负电荷，减少分子间的静电排斥，从而促进探针与靶标的结合。相比之下，Na?作为单价阳离子，其屏蔽效果较弱，因此对杂交效率的提升有限。

进一步的实验分析表明，Mg2?在30至100 mM浓度范围内，不仅增强了miRNA与PNA探针的结合速率，还显著降低了杂交后异二聚体的解离速率，从而提高了杂交的稳定性。这种稳定性有助于在SPRI检测中获得更强的信号响应，提高检测的灵敏度。然而，当Mg2?浓度超过100 mM（如300 mM）时，其作用发生逆转，导致杂交效率下降。这一现象可能与过量的Mg2?引起的静电排斥或结构变化有关。高浓度的Mg2?可能会在miRNA分子之间形成过多的相互作用，导致其构象变化，从而影响与PNA探针的结合能力。

相比之下，Na?对PNA–miRNA杂交的影响较小。实验结果显示，即使将Na?浓度提高至600 mM，其对杂交效率的提升仍然有限，且其信号强度始终低于Mg2?的作用。这一结果表明，Mg2?在促进PNA–miRNA杂交方面具有更显著的优势。此外，Mg2?的电荷密度较高，因此其对静电相互作用的调控能力更强，能够更有效地中和miRNA的负电荷，减少分子间的排斥作用，从而促进杂交反应的进行。

### SPR成像技术在miRNA检测中的应用

SPR成像技术通过实时监测表面分子间相互作用的变化，能够提供高分辨率的杂交信号。在本研究中，SPRI被用于评估不同离子浓度对PNA–miRNA杂交的影响。实验设计中，PNA探针被固定在DTSP修饰的金芯片表面，而miRNA靶标则被加入到含有不同浓度Mg2?或Na?的PBS缓冲液中。通过比较不同离子条件下的SPRI信号强度，研究人员发现，Mg2?在30至100 mM浓度范围内显著增强了杂交信号，而Na?则表现出较弱的调控作用。

为了进一步验证Mg2?对杂交过程的影响，研究团队还进行了熔解曲线分析。该分析用于评估PNA–miRNA异二聚体的热稳定性，以排除离子浓度对杂交过程的间接影响。实验结果显示，Mg2?的加入虽然提高了异二聚体的热稳定性，但其对SPRI信号的增强作用并不能完全通过热稳定性来解释。这表明，Mg2?的作用可能更多地体现在表面杂交过程中，而非溶液中的杂交行为。这一发现强调了表面固定条件在PNA–miRNA杂交中的关键作用。

### 优化离子浓度对生物传感器性能的影响

本研究的结果对miRNA生物传感器的设计和优化具有重要指导意义。首先，Mg2?在适当浓度下（30至100 mM）能够显著提高生物传感器的灵敏度和检测效率。这为在低浓度miRNA检测中提高信号强度提供了理论依据。其次，Mg2?对杂交过程的调控作用不仅体现在信号强度的提升，还体现在杂交过程的动态特性上。例如，Mg2?能够有效减少异二聚体的解离速率，从而提高检测的稳定性。这种稳定性对于长期监测miRNA浓度变化或在复杂生物样本中进行检测尤为重要。

然而，过量的Mg2?（如300 mM）可能会导致杂交效率下降，这提示在实际应用中需要严格控制离子浓度，以避免不必要的干扰。此外，Na?的加入对杂交效率的提升有限，这表明在设计miRNA生物传感器时，应优先考虑Mg2?的使用，而非Na?。这一结论为未来的miRNA检测方法提供了新的思路，即通过优化离子环境，提高生物传感器的性能。

### 研究的意义与未来方向

本研究的发现不仅有助于理解Mg2?和Na?在PNA–miRNA杂交过程中的作用机制，也为miRNA生物传感器的优化提供了实验支持。通过调节离子浓度，研究人员可以有效提升传感器的灵敏度和特异性，从而实现对低浓度miRNA的准确检测。这对于癌症早期诊断、疾病监测以及个性化医疗具有重要价值。此外，研究还表明，表面固定条件对杂交过程的影响不容忽视，因此在设计生物传感器时，需要综合考虑探针密度、表面结构以及缓冲液成分等因素。

未来的研究可以进一步探索不同离子条件对其他类型的PNA–RNA杂交的影响，以及如何在不同生物环境中优化离子浓度。此外，可以结合其他先进的检测技术，如荧光标记或电化学传感，以提高检测的准确性和可靠性。同时，针对不同miRNA的序列特征和结构特性，开发更加特异和高效的PNA探针，也将是未来研究的重要方向。

总之，本研究通过系统分析Mg2?和Na?对PNA–miRNA杂交过程的影响，揭示了离子浓度在调控生物传感器性能中的关键作用。这一成果为miRNA检测技术的发展提供了新的思路和实验依据，有望在未来的生物医学研究和临床诊断中发挥重要作用。