通过悬浮光机械技术实现寡核苷酸的选择性检测

《ACS Nanoscience Au》：Oligonucleotide Selective Detection by Levitated Optomechanics

光镊机械分析技术通过检测二氧化硅纳米颗粒表面修饰的25A和25T寡核苷酸导致的机械振动频率和幅度变化，成功区分了不同功能化纳米颗粒。研究采用洛伦兹曲线拟合提取f1、f2、f3频率参数，结合UMAP降维和随机森林模型分析，发现修饰颗粒与未修饰标准颗粒在特征空间存在显著分离（准确率87%和73%）。透射电镜未观察到视觉差异，但理论模型显示DNA修饰改变了极化率/质量比（约1kHz/层）。该技术为DNA检测提供了新方法，在诊断医学和生物信息学中有潜在应用。

　　本研究探讨了一种在敏感的光力学实验中检测寡核苷酸特异性信号的方法。通过使用锌氯化物（ZnCl?）对二氧化硅纳米颗粒进行功能化处理，并将25个碱基长度的单链脱氧腺苷酸（25A）和脱氧胸苷酸（25T）单磷酸核苷结合到二氧化硅纳米颗粒表面，研究人员利用1550纳米波长的激光在真空中对这些纳米颗粒进行光学捕获。在光学捕获过程中，二氧化硅纳米颗粒表现出类似于简谐振子的行为，其振动频率和振幅可以通过光学干涉测量技术精确检测。通过对不同纳米颗粒类型的实验数据进行比较，研究人员发现，纳米颗粒的运动特性在频率、宽度和振幅上存在差异，这些差异可以用理论模型进行解释。

在本研究中，数据通过拟合洛伦兹曲线对光谱进行分析。通过降维技术，如统一流形逼近与投影（UMAP），研究人员能够更有效地识别和分类这些纳米颗粒组别。同时，随机森林模型也被用于进一步验证这些组别在数据拟合中的差异。此外，透射电子显微镜（TEM）也被用于尝试可视化纳米颗粒之间的差异，但结果显示这些纳米颗粒在形态上没有明显的区别。

检测和区分DNA分子在医学、数据存储和进化生物学等领域具有重要应用价值。因此，开发更快速、更准确的研究方法来探索DNA分子成为当前研究的重点。1977年，Sanger测序方法被提出，而近年来，平行化和高通量技术已成为现代DNA测序的常规手段。本研究提出了一种基于DNA核苷酸光学性质的新方法，以实现对DNA分子的识别。

光学捕获技术最初由Arthur Ashkin在1970年发现，用于捕获微米级的粒子。这种技术后来在生物传感和活细胞成像中得到广泛应用。而在真空中进行的光学捕获通常被称为悬浮光力学（levitated optomechanics），这是本研究采用的方法。通过悬浮光力学，可以测量捕获粒子所受的微小力，其量值约为10?2?牛，这表明如果纳米颗粒被功能化处理，其光学性质可能与未进行表面修饰的纳米颗粒有所不同。

二氧化硅纳米颗粒因其在近红外波长下的高折射率，常被用于光学捕获，这是在水中进行稳定捕获的必要条件。早期的光学捕获实验中，Ashkin和Dziedzic曾使用20微米直径的二氧化硅纳米颗粒，并在1毫巴压力下实现其悬浮。在选择材料时，应考虑其高极化率和低吸收率，而二氧化硅在1550纳米波长下满足这些条件。因此，本研究选择了二氧化硅纳米颗粒作为实验材料。

DNA分子在纳米颗粒表面的吸附过程研究较少。金属离子在生物体内起着关键作用，不仅参与生物过程的调节，还作为DNA酶的辅因子。一项研究曾探讨使用不同金属离子作为结合剂，将带有荧光素标记的短DNA分子吸附到二氧化硅纳米颗粒表面的方法。他们发现，ZnCl?溶液中浓度为1毫摩尔的Zn2?离子是吸附荧光素标记的25个碱基脱氧腺苷酸单磷酸核苷的最佳选择。尽管本研究未进行光学捕获实验，但该研究为本研究中使用的功能化方法提供了理论基础。

本研究采用了一种在真空中释放纳米颗粒进入光学捕获装置的实验方法，如图1所示。超声波设备被用于减少纳米颗粒在释放到光学捕获装置中的聚集现象。通过这种实验方法，研究人员能够获取更清晰的信号，并用于后续分析。

在实验过程中，纳米颗粒被假设处于热平衡状态，其温度为300开尔文。纳米颗粒的半径通过洛伦兹曲线拟合后的参数计算得出，该方法在文献中已有应用。根据文献，纳米颗粒的半径可以通过以下公式计算：
$$ r = \frac{0.619 \times 9 \times \pi}{\sqrt{2}} \times \frac{\eta_{air} \times d^2}{\rho \times k_B \times T_0} \times \frac{P_{gas}}{C} $$
其中，$ r $ 是纳米颗粒的半径，$ \eta_{air} $ 是空气的粘度，$ d $ 是大气中粒子的直径，$ P_{gas} $ 是由压力传感器测得的压力，$ \rho $ 是粒子材料的密度，$ k_B $ 是玻尔兹曼常数，$ T_0 $ 是环境温度，$ C $ 是阻尼率。

在实验中，数据集中的异常值被过滤并移除。异常值被定义为在中位数之外超过1.5个四分位数范围的数值。完整的原始数据集可在支持信息中找到。由于二氧化硅纳米颗粒的尺寸存在显著差异，这是进行数据过滤的主要原因。本研究中的数据分析均未包含异常值。

原始的功率谱密度（PSD）数据被用于比较每种二氧化硅纳米颗粒的特性。每个组别中选择一个候选样本，并将$ f_1 $、$ f_2 $和$ f_3 $频率峰以分段形式展示，以便进行比较。图2的两个面板均突出了不同纳米颗粒之间的差异。在图2a中，所有频率峰在PSD中表现出明显的分离，包括宽度、振幅和频率。而在图2b中，不同ZnCl?浓度下的25T功能化二氧化硅纳米颗粒在频率峰上表现出差异，除了500微摩尔和750微摩尔ZnCl?浓度下的25T纳米颗粒之间相似，其PSD在频率、振幅和宽度上非常接近。

本研究中，观察到在悬浮光力学陷阱中，寡核苷酸修饰的二氧化硅纳米颗粒的捕获频率发生了变化。物理模型解释了这种频率偏移现象，假设忽略了纳米颗粒表面的ZnCl?盐层。该模型发现，极化率与质量的比值（α/m）会随着寡核苷酸的不同而变化。正是这种比值的变化，而非质量本身，导致了频率偏移。极化率与质量的比值在计量学中被广泛应用，以补充质谱分析，并用于分离富勒烯和多肽。估计显示，每层DNA碱基分子会引起约1千赫兹的频率偏移。腺嘌呤和胸腺嘧啶之间的差异表明，单个腺嘌呤分子相对于单个胸腺嘧啶分子会引起约30毫赫兹的频率偏移。

降维技术在机器学习领域被广泛用于压缩具有大量特征的数据集，将其压缩为更易管理的组件。该技术降低了数据的复杂性，提高了分类的准确性。UMAP是一种降维技术，可以在监督学习模式下运行，以最大化已知类在低维空间中的间距，其中特征之间存在非线性相关性。该方法因其在分析各种高维数据时的灵活性而被选中。通过将收集到的数据应用UMAP，研究人员能够以二维图形表示的方式观察不同组别之间的差异。

随机森林是一种集成机器学习算法，被广泛用于分类和回归建模。集成技术比其他机器学习方法（如支持向量机和K近邻）具有更高的准确性，因为一组分类器通常比单个分类器更准确。随机森林由一组决策树组成，每棵树提供自己的分类结果，这些结果通过投票形成分类共识。总体的随机森林算法考虑了所有树中分类结果的投票，以获得最佳模型准确性。由于数据集的大小有限，25A和25T纳米颗粒在1000微摩尔ZnCl?浓度下的数据共有64个条目，而不同ZnCl?浓度下的25T纳米颗粒数据共有66个条目，因此采用了蒙特卡洛交叉验证（MCCV）方法，以更全面地评估随机森林模型的性能。

图4a显示，随机森林模型在300次MCCV迭代中表现出良好的性能，最佳情况下为完美准确，最差情况下为62%准确，平均准确率为87%。这与图3a中的UMAP图一致，表明粒子类型的分类并非随机。在图4b中，模型的平均准确率为73%，最低为50%，最高为93%。图4b中的平均准确率低于图4a，可能是因为500微摩尔和750微摩尔ZnCl?浓度下的25T纳米颗粒在DNA结合方面表现出相似性。图4c中显示的平均特征重要性顺序在两个模型中一致，但重要性的幅度有所不同。$ f_2 $和$ f_3 $的A参数最为重要，而$ f_1 $和$ f_2 $的半径则排在最后。这表明这些特征在分类粒子组别时具有持续的重要性。$ f_3 $的半径未被任何迭代使用，因此未在图中显示。

透射电子显微镜（TEM）用于观察DNA分子存在一定的挑战。一项研究成功地利用高分辨率TEM在70千电子伏特下观察到DNA双螺旋的主沟、次沟和螺旋节距等特征，但推断碱基序列仍存在困难。此外，重金属染色方法如醋酸铀可用于TEM观察DNA，但由于其放射性，这种方法存在风险。相比之下，TEM成像二氧化硅纳米颗粒较为简便，因为纳米颗粒能提供良好的对比度，便于可视化。

本研究中，所有在光学捕获中测试的纳米颗粒类型均进行了TEM成像。使用与图1相同的样品制备方法，研究人员能够观察到纳米颗粒的尺寸和形状变化。这是数据过滤的原因，因为尺寸上的显著差异可能源于物理特性而非光学特性。尽管在纳米颗粒溶液中使用了超声波设备，但在成像过程中仍存在纳米颗粒的聚集现象。表面粗糙的白色纹理代表了纳米颗粒的表面不规则性，它们并非完美的球形。然而，研究人员未观察到纳米颗粒组别之间的明显视觉差异。

为了克服TEM成像中无法区分二氧化硅纳米颗粒组别的问题，未来的研究可以考虑使用扫描电子显微镜（SEM）和能量色散X射线光谱（EDS）技术。这种技术可以检测原子序数大于11的元素，因此能够识别DNA功能化的二氧化硅纳米颗粒中添加的锌和磷元素，与未功能化的标准纳米颗粒进行比较。

数据集的规模是本研究的一个限制因素，如图3中的UMAP图所示。为了扩展这一分析，需要生成更大的数据集。然而，MCCV结果表明，通过不同训练和测试数据的迭代，可以增强对随机森林模型分类结果的信心。

使用分类器来区分DNA分子可能在诊断测试中具有应用前景，尤其是在当前测序技术难以处理GC富集区域或重复区域的情况下。本研究中选择了25A和25T寡核苷酸，因为它们已被证明能够很好地与Zn2?结合到二氧化硅纳米颗粒表面。然而，它们在碱基序列上也存在最大程度的差异。为了进一步应用这种方法，需要改变碱基序列，例如将碱基改为24T并引入一个腺嘌呤，或者改变整个链的长度和序列。此外，本研究未探讨双链DNA的影响。实验使用25A–25T双链DNA可能会揭示DNA结构的独特性。例如，另一个磷酸二酯骨架或更大的质量可能会对数据的聚类方式产生影响。

综上所述，本研究可能为未来的研究提供多个方向。提出的模型中，30毫赫兹的频率偏移可以被进一步实验验证，以确定其是否可以用于识别DNA碱基序列的微小质量变化。如果这一现象被实验证实，那么检测DNA序列差异的能力可能在识别DNA的突变或甲基化修饰方面具有应用价值。未来的发展需要正确预见该技术的潜在应用。进一步的研究需要探索导致不同光学性质的潜在原因，这可能有助于理解UMAP聚类和随机森林分类的结果。随着生物信息学在现代医学中的重要性不断提升，这种光学捕获分类器可能成为工具箱中的另一种方法。