利用DNA折纸技术实现生物分子图案的纳米级精确冲压

《ACS Nano》：Nanoscale Precise Stamping of Biomolecule Patterns Using DNA Origami

高效纳米图案化技术及单分子成像分析

　　在生物科学领域，理解配体（ligand）在生物过程中的作用至关重要。这一理解不仅有助于揭示生物分子之间的相互作用机制，还能为调控生物反应提供新的思路。然而，实现对配体排列的精确控制，尤其是在纳米尺度上，是研究这些过程的关键挑战之一。DNA折纸技术（DNA origami）为生物分子的纳米级排列提供了高度的精确性，但其在实际生物应用中仍然受到结构稳定性、可扩展性以及表面覆盖能力等方面的限制。为了解决这些问题，我们提出了一种新的DNA折纸“印章”技术，该技术能够将纳米尺度的寡核苷酸（oligonucleotide）图案转移到表面，并通过DNA点积累成像（DNA-PAINT）技术实现对图案转移效率和精度的定量分析。

DNA折纸技术的基本原理是利用DNA分子的自组装特性，通过特定的碱基配对和结构设计，构建出具有特定形状和功能的纳米结构。这些结构可以作为“模板”或“掩膜”，用于引导生物分子的排列，从而模拟细胞表面的配体分布。然而，传统方法在实现这一目标时往往依赖昂贵的设备，限制了其在实验室中的广泛应用。相比之下，我们提出的“自下而上”（bottom-up）方法提供了一种更加经济、易行的途径，能够通过调整寡核苷酸的连接方式，适配不同类型的表面，从而实现更广泛的生物应用。

该方法的核心在于设计一种双层结构的DNA折纸“印章”，其形状和尺寸经过优化，以确保在转移过程中图案的稳定性和准确性。通过将寡核苷酸（PTO）连接到折纸结构的特定位置，并利用生物素-链霉亲和素（biotin-neutravidin）相互作用实现对印章的固定，我们成功地实现了纳米级的图案转移。在转移过程中，通过引入“入侵”寡核苷酸（invader），可以触发折纸结构的释放，从而在表面留下精确的寡核苷酸图案。这种方法不仅避免了传统“自上而下”方法的限制，还能够结合单分子定位成像技术（SMLM）实现对纳米级图案的高分辨率可视化。

DNA折纸作为“印章”的应用，使得生物分子在表面的排列能够以更高的精度和可控性进行操作。这种技术特别适用于研究距离依赖的生物过程，例如受体激活、多价结合以及酶促反应等。通过将DNA折纸与单分子成像技术相结合，我们不仅能够实现对图案的定量分析，还能够扩展研究的范围，使其适用于不同的检测手段和实验条件。此外，使用经过修饰的表面（如聚乙二醇修饰的玻璃载玻片）能够有效减少非特异性结合，提高实验的准确性和可重复性。

为了进一步验证这一技术的可行性，我们进行了多组实验，包括对不同类型的折纸印章进行性能评估，以及对图案转移后的定位精度进行分析。通过DNA-PAINT技术，我们能够实现对单个寡核苷酸的高分辨率成像，并通过定量分析评估图案转移的效率和准确性。实验结果表明，不同类型的印章在转移效率和精度上存在差异，其中三生物素寡核苷酸（3xBiotin-PTO）在某些情况下表现出更高的稳定性，能够减少失败的图案转移。同时，我们也发现，使用较长的连接臂（如7T-PTO）可能会影响图案的精度，导致部分区域的偏差增大。

此外，我们还探讨了不同表面处理方式对图案转移的影响。通过将折纸印章固定在经过修饰的表面，能够确保其在转移过程中不会受到外界干扰，从而保持图案的完整性。实验中使用的表面经过聚乙二醇修饰，不仅具有抗污染的特性，还能提供稳定的结合环境，提高实验的可重复性和可靠性。通过将折纸印章与表面结合后，利用化学裂解或变性方法将其去除，使得表面仅保留转移后的寡核苷酸图案，为后续的生物实验提供了清晰的底物。

为了进一步提高图案转移的效率和精度，我们设计了一种新的“7点”图案，通过增加图案的复杂度，测试了不同类型的折纸印章在转移多个寡核苷酸时的表现。结果表明，虽然“7点”图案能够提供更高的密度，但其在某些情况下会导致图案转移的失败率上升，这可能与折纸结构的稳定性有关。此外，我们还发现，使用不同的连接方式（如三生物素连接）可以提高图案的完整性，使得更多的寡核苷酸成功转移。

在实验过程中，我们使用了多种成像技术，包括表面等离子共振（SPR）和原子力显微镜（AFM），以评估折纸印章的性能。这些技术能够提供对表面图案的宏观和微观分析，从而帮助我们更好地理解DNA折纸作为“印章”的潜力。同时，通过DNA-PAINT技术，我们能够实现对单个寡核苷酸的高分辨率成像，并通过图像处理软件进行分析，从而提高对图案转移的精度评估。

我们还对折纸印章的结构进行了详细分析，以确保其在转移过程中的稳定性。通过透射电子显微镜（TEM）成像，我们能够观察到折纸结构的形态，并评估其在转移过程中的变形情况。结果表明，某些类型的折纸印章在转移过程中可能会发生轻微的系统性变形，影响图案的准确性。然而，通过优化连接方式和结构设计，我们能够显著减少这种变形，提高图案的精度。

此外，我们还探讨了不同检测技术对图案转移的影响。例如，使用单分子定位成像（SMLM）技术，如DNA-PAINT，能够提供更精确的定位信息，从而帮助我们更好地理解寡核苷酸在表面的分布情况。通过将折纸印章与表面结合后，利用特定的荧光标记，我们能够实现对寡核苷酸的可视化，并通过图像处理软件进行分析，从而提高对图案转移的精度评估。

最后，我们总结了这一方法的潜力和应用前景。该方法不仅能够提高生物分子在表面的排列精度，还能够扩展研究的范围，使其适用于不同的生物过程和实验条件。通过结合DNA折纸技术和单分子成像技术，我们能够实现对纳米尺度图案的精确控制，从而为生物研究提供新的工具和方法。未来，这一方法有望在更广泛的生物应用中发挥作用，包括对生物分子相互作用机制的研究，以及对多价结合和酶促反应的探索。通过进一步优化折纸结构和表面处理方式，我们相信这一技术能够为生物研究提供更加精确和高效的解决方案。